本發(fā)明涉及生物組織工程，具體涉及一種年輕間充質(zhì)干細(xì)胞來源凋亡小體及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、腰椎間盤退變（intervertebral?disc?degeneration,ivdd）是引發(fā)慢性腰背痛、神經(jīng)根性疼痛及功能障礙的主要因素之一。其核心病理機制涉及髓核細(xì)胞（nucleuspulposus?cells,npcs）的衰老與凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular?matrix,ecm）的合成與降解失衡。髓核細(xì)胞的異常變化和細(xì)胞外基質(zhì)代謝紊亂會相互影響、協(xié)同作用，進(jìn)而破壞椎間盤內(nèi)部原本穩(wěn)定的微環(huán)境，形成炎癥微環(huán)境。這種不良的病理狀態(tài)會形成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致椎間盤結(jié)構(gòu)損傷、功能喪失及疼痛產(chǎn)生。
2、目前，中晚期ivdd臨床治療手段主要有物理治療、藥物鎮(zhèn)痛及外科手術(shù)，如髓核摘除術(shù)、椎間融合術(shù)，但這些方法僅能暫時緩解癥狀或進(jìn)行結(jié)構(gòu)性重建，無法逆轉(zhuǎn)椎間盤退變生物學(xué)進(jìn)程，也不能實現(xiàn)功能性再生。
3、組織工程與再生醫(yī)學(xué)為ivdd治療帶來新契機，其中，干細(xì)胞療法因具備多向分化潛能與旁分泌效應(yīng)，被視為極具潛力的治療策略。然而，基于活細(xì)胞的治療方式面臨細(xì)胞來源受限、體內(nèi)存活率低、免疫排斥風(fēng)險、成瘤性擔(dān)憂以及制備與監(jiān)管要求復(fù)雜等諸多挑戰(zhàn)。近年來，“無細(xì)胞治療”策略備受關(guān)注，其通過遞送干細(xì)胞來源的生物活性物質(zhì)，如外泌體、凋亡囊泡、條件培養(yǎng)基等，模擬干細(xì)胞治療效應(yīng)，同時規(guī)避活細(xì)胞應(yīng)用固有風(fēng)險。
4、凋亡小體（apoptotic?bodies,abs）是程序性死亡細(xì)胞產(chǎn)生的膜包被囊泡，曾被視為需清除的“細(xì)胞碎片”。但最新研究發(fā)現(xiàn)，其富含蛋白質(zhì)、核酸（如mrna、mirna）及細(xì)胞器片段等生物活性物質(zhì)，是“信號包裹”，可被周圍細(xì)胞攝取并調(diào)控其生物學(xué)行為，在組織穩(wěn)態(tài)維持、免疫調(diào)節(jié)與再生修復(fù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。然而，現(xiàn)有技術(shù)缺乏針對間充質(zhì)干細(xì)胞的標(biāo)準(zhǔn)化誘導(dǎo)方案，在誘導(dǎo)參數(shù)優(yōu)化、凋亡小體高效收集與純化、質(zhì)量控制和活性保持等方面存在明顯不足。更重要的是，現(xiàn)有研究尚未系統(tǒng)探索間充質(zhì)干細(xì)胞來源凋亡小體在椎間盤退變延緩、逆轉(zhuǎn)治療中的應(yīng)用價值。
技術(shù)實現(xiàn)思路
1、本發(fā)明的目的在于提供一種年輕間充質(zhì)干細(xì)胞來源凋亡小體，用于改善退變微環(huán)境并促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成。
2、本發(fā)明還提供了上述年輕間充質(zhì)干細(xì)胞來源凋亡小體的應(yīng)用，通過將其應(yīng)用于延緩、逆轉(zhuǎn)或治療椎間盤退變領(lǐng)域，解決基于活細(xì)胞的治療方式所面臨細(xì)胞來源受限、體內(nèi)存活率低、免疫排斥風(fēng)險的問題。
3、為達(dá)到上述目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：一種年輕間充質(zhì)干細(xì)胞來源凋亡小體，該凋亡小體由年輕間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)星形孢菌素誘導(dǎo)凋亡后形成，用于抑制衰老相關(guān)因子的表達(dá)水平，并促進(jìn)基質(zhì)合成相關(guān)因子的表達(dá)；所述衰老相關(guān)因子為p21、p53、cxcl1、ccl2、cxcl10及ccl7中的一種或多種；所述基質(zhì)合成相關(guān)因子為acan、col?ⅱ及col?i中的一種或多種。
4、進(jìn)一步地，所述年輕間充質(zhì)干細(xì)胞來源于供體年齡不超過24歲的骨髓組織。
5、進(jìn)一步地，所述凋亡小體的粒徑為500nm～5μm。
6、本申請還提供了上述年輕間充質(zhì)干細(xì)胞來源凋亡小體在制備延緩或逆轉(zhuǎn)腰椎間盤退變的藥物中的應(yīng)用。
7、本申請還提供了上述年輕間充質(zhì)干細(xì)胞來源凋亡小體的應(yīng)用，包括：將所述凋亡小體負(fù)載于水凝膠微球上，配制形成適用于腰椎間盤微創(chuàng)注射的制劑。
8、本申請還提供了上述年輕間充質(zhì)干細(xì)胞來源凋亡小體的制備方法，包括以下步驟：
9、s1、獲取間充質(zhì)干細(xì)胞，將獲取的所述間充質(zhì)干細(xì)胞與培養(yǎng)基混合，配制成細(xì)胞懸液，并加入到培養(yǎng)皿中進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)；
10、s2、當(dāng)細(xì)胞生長至覆蓋培養(yǎng)皿底面積的80%～95%時，將包括星形孢菌素的培養(yǎng)基加入培養(yǎng)皿，進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)；
11、s3、待誘導(dǎo)結(jié)束后，收集培養(yǎng)皿中的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，并對所述細(xì)胞培養(yǎng)上清液進(jìn)行離心處理，以獲取上清液，對所述上清液進(jìn)行高速離心處理，收集得到沉淀；
12、s4、對收集得到的所述沉淀進(jìn)行洗滌處理，得到凋亡小體。
13、進(jìn)一步地，所述細(xì)胞懸液中，所述間充質(zhì)干細(xì)胞的密度為2800個/cm2～3200個/cm2；
14、所述培養(yǎng)基包括88%～90%的α-mem培養(yǎng)基、9%～11%的胎牛血清以及0.8%～1.2%的青霉素-鏈霉素。
15、進(jìn)一步地，所述包括星形孢菌素的培養(yǎng)基中，星形孢菌素的含量為0.3μm～0.7μm；
16、步驟s2中，所述誘導(dǎo)培養(yǎng)包括于溫度為36℃～37℃的溫度、95%空氣與5%?co2的氣氛及濕度為70%～95%的條件下，培養(yǎng)20h～24h。
17、進(jìn)一步地，步驟s3中，所述離心處理的處理溫度為0℃～5℃，相對離心力為200×g～500×g；所述高速離心處理的相對離心力為14000×g～16000×g。
18、進(jìn)一步地，步驟s4中，所述洗滌處理包括使用預(yù)冷緩沖液對所述沉淀進(jìn)行重懸處理，形成重懸溶液，對所述重懸溶液進(jìn)行離心處理，以棄去上清液。
19、本發(fā)明的有益效果在于：本申請?zhí)峁┑哪贻p間充質(zhì)干細(xì)胞來源的凋亡小體，能夠顯著降低衰老相關(guān)因子的表達(dá)水平，同時上調(diào)基質(zhì)合成相關(guān)因子的表達(dá)水平，從而改善退變微環(huán)境并促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)合成，改善細(xì)胞功能。該凋亡小體也具有良好的生物相容性和安全性，能夠適合用于臨床治療。
20、本申請?zhí)峁┑哪贻p間充質(zhì)干細(xì)胞來源的凋亡小體能夠應(yīng)用于延緩、逆轉(zhuǎn)椎間盤退變領(lǐng)域，其通過遞送“年輕化信號”來促進(jìn)椎間盤組織的修復(fù)和再生，為椎間盤退變的治療提供了一種新的無細(xì)胞治療策略，避免細(xì)胞存活率低、免疫排斥及成瘤性等風(fēng)險，同時突破傳統(tǒng)通過物理或藥物手段恢復(fù)組織功能的局限。
21、本申請可通過將凋亡小體負(fù)載于水凝膠微球中，構(gòu)建一種可注射的遞送系統(tǒng)，能夠確保在體內(nèi)實現(xiàn)持續(xù)、精確的治療劑量遞送，并且，在保持凋亡小體的活性和功能的同時，保證凋亡小體的持續(xù)釋放，增強治療效果。通過精準(zhǔn)調(diào)控凋亡小體的來源和特性，可以進(jìn)一步提高凋亡小體在組織修復(fù)中的應(yīng)用效果，特別是“年輕化”信號的遞送，顯著增強其在衰老、退變組織中的再生潛力。
22、本申請?zhí)峁┑闹苽浞椒ǎ峭ㄟ^利用星形孢菌素誘導(dǎo)年輕間充質(zhì)干細(xì)胞形成凋亡小體，并優(yōu)化誘導(dǎo)條件，實現(xiàn)年輕間充質(zhì)干細(xì)胞來源凋亡小體的標(biāo)準(zhǔn)化制備，顯著提高凋亡小體的產(chǎn)量與質(zhì)量，最大化保留了其生物活性，解決了現(xiàn)有技術(shù)中凋亡小體制備不規(guī)范、效率低等問題。
23、上述說明僅是本發(fā)明技術(shù)方案的概述，為了能夠更清楚地了解本發(fā)明的技術(shù)手段，并可依照說明書的內(nèi)容予以實施，以下以本發(fā)明的較佳實施例并配合附圖詳細(xì)說明如后。
1.一種年輕間充質(zhì)干細(xì)胞來源凋亡小體，其特征在于，凋亡小體由年輕間充質(zhì)干細(xì)胞經(jīng)星形孢菌素誘導(dǎo)凋亡后形成，用于抑制衰老相關(guān)因子的表達(dá)水平，并促進(jìn)基質(zhì)合成相關(guān)因子的表達(dá)；所述衰老相關(guān)因子為p21、p53、cxcl1、ccl2、cxcl10及ccl7中的一種或多種；所述基質(zhì)合成相關(guān)因子為acan、col?ⅱ及col?i中的一種或多種。
2.如權(quán)利要求1所述的年輕間充質(zhì)干細(xì)胞來源凋亡小體，其特征在于，所述年輕間充質(zhì)干細(xì)胞來源于供體年齡不超過24歲的骨髓組織。
3.如權(quán)利要求1所述的年輕間充質(zhì)干細(xì)胞來源凋亡小體，其特征在于，所述凋亡小體的粒徑為500nm～5μm。
4.權(quán)利要求1～3任意一項所述的年輕間充質(zhì)干細(xì)胞來源凋亡小體在制備延緩或逆轉(zhuǎn)腰椎間盤退變的藥物中的應(yīng)用。
5.權(quán)利要求1～3任意一項所述的年輕間充質(zhì)干細(xì)胞來源凋亡小體的應(yīng)用，其特征在于，包括：將所述凋亡小體負(fù)載于水凝膠微球上，配制形成適用于腰椎間盤微創(chuàng)注射的制劑。
6.權(quán)利要求1～3任意一項所述的年輕間充質(zhì)干細(xì)胞來源凋亡小體的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：
7.如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述細(xì)胞懸液中，所述間充質(zhì)干細(xì)胞的密度為2800個/cm2～3200個/cm2；
8.如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，所述包括星形孢菌素的培養(yǎng)基中，星形孢菌素的含量為0.3μm～0.7μm；
9.如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，步驟s3中，所述離心處理的處理溫度為0℃～5℃，相對離心力為200×g～500×g；所述高速離心處理的相對離心力為14000×g～16000×g。
10.如權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，步驟s4中，所述洗滌處理包括使用預(yù)冷緩沖液對所述沉淀進(jìn)行重懸處理，形成重懸溶液，對所述重懸溶液進(jìn)行離心處理，以棄去上清液。