本發(fā)明屬于生物化工，具體涉及一種p450融合蛋白、基因工程菌及其在合成骨化二醇中的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、骨化二醇（25-羥基維生素d3）是維生素d3在體內(nèi)的主要活性代謝產(chǎn)物，在鈣磷代謝調(diào)節(jié)、免疫調(diào)節(jié)及骨骼健康維持等方面具有重要作用，廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健品及功能性食品領(lǐng)域。目前，骨化二醇的工業(yè)化生產(chǎn)仍主要依賴化學(xué)合成法，存在反應(yīng)步驟復(fù)雜、副產(chǎn)物多、環(huán)境污染嚴(yán)重等問題。隨著合成生物學(xué)和酶工程技術(shù)的發(fā)展，基于細(xì)胞色素p450酶系的生物催化法因其反應(yīng)條件溫和、選擇性高、環(huán)境友好等優(yōu)勢，被視為一種具有潛力的綠色合成替代途徑。
2、細(xì)胞色素p450酶是一類廣泛存在于生物體內(nèi)的單加氧酶，其催化功能依賴于氧化還原伴侶（如鐵氧還蛋白還原酶和鐵氧還蛋白）組成的電子傳遞鏈，為p450酶提供催化過程中必需的電子。在維生素d3的25位羥基化反應(yīng)中，氧化還原伴侶的種類和性質(zhì)直接影響p450酶的催化效率與產(chǎn)物選擇性。不同的氧化還原伴侶系統(tǒng)往往導(dǎo)致副產(chǎn)物（如其它位置羥基化的維生素d3衍生物）的生成，從而降低目標(biāo)產(chǎn)物骨化二醇的純度和產(chǎn)率。
3、目前已有研究嘗試?yán)胮450酶與不同來源的氧化還原伴侶組合實(shí)現(xiàn)骨化二醇的生物合成，但存在以下問題：（1）不同來源的氧化還原伴侶與p450酶的適配性差，電子傳遞效率低，導(dǎo)致整體催化活性不高；（2）氧化還原伴侶與p450酶之間的空間定位與協(xié)同作用機(jī)制不明確，難以實(shí)現(xiàn)高效、穩(wěn)定的共表達(dá)與共催化；（3）現(xiàn)有技術(shù)中缺乏對連接肽（linker）的系統(tǒng)篩選與優(yōu)化，影響融合蛋白的構(gòu)象穩(wěn)定性、結(jié)構(gòu)柔性及催化性能。
4、因此，如何構(gòu)建一種高效、高選擇性、催化性能穩(wěn)定的全能型p450融合蛋白，并在此基礎(chǔ)上開發(fā)相應(yīng)的基因工程菌，實(shí)現(xiàn)骨化二醇的高效合成，已成為本領(lǐng)域亟待解決的技術(shù)難題。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、為解決背景技術(shù)中提出的問題，本發(fā)明提出了一種p450融合蛋白、基因工程菌及其在合成骨化二醇中的應(yīng)用，通過系統(tǒng)篩選，確定了來源于不動桿菌的acic/acib氧化還原伴侶系統(tǒng)與vdhm3?p450酶具有最佳適配性，其催化活性（37?u）遠(yuǎn)高于其他測試系統(tǒng)，且對目標(biāo)產(chǎn)物骨化二醇的選擇性高達(dá)95%，大幅減少了副產(chǎn)物的生成，提高了產(chǎn)物的純化效率與收率。
2、本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是：提供一種p450融合蛋白，所述融合蛋白的結(jié)構(gòu)為vdhm3-linker1-acic-linker2-acib，其氨基酸序列如如seq?id?no?.1所示；
3、其中：vdhm3為vdh-m3(i144r/n173m/q310r)，其氨基酸序列如seq?id?no?.2所示；acic和acib其編碼基因的genbank登錄號均為ab221118.1；linker2的氨基酸序列為gsgsgh，如seq?id?no?.15所示；linker1為柔性連接子、剛性連接子或柔性-剛性組合連接子。
4、進(jìn)一步地，所述linker1選自以下氨基酸序列之一：
5、l1、gsgsgsgs，如seq?id?no?.3所示；
6、l2、ggggsggggsggggsggggs，如seq?id?no?.4所示；
7、l3、ggggsggggsggggsggggsggggs，如seq?id?no?.55所示；
8、l4、eaaakeaaak，如seq?id?no?.6所示；
9、l5、eaaakeaaakeaaak，如seq?id?no?.7所示；
10、l6、eaaakeaaakeaaakeaaak，如seq?id?no?.8所示；
11、l7、akttpkleegefsear，如seq?id?no?.9所示；
12、l8、apapaps，如seq?id?no?.10所示；
13、l9、aeaaakeaaakeaaakeaaaka，如seq?id?no?.11所示；
14、l10、eaaakgsgeaaak，如seq?id?no?.12所示；
15、l11、ggsggeaaakeaaakggsgg，如seq?id?no?.13所示；
16、l12、ggsggskpgtssgeetesgggsgg，如seq?id?no?.14所示。
17、編碼p450融合蛋白的基因，按“vdhm3基因-linker1編碼序列-acic基因-linker2編碼序列-acib基因”的順序串聯(lián)形成，且經(jīng)大腸桿菌密碼子偏好性優(yōu)化。
18、本發(fā)明還提供一種重組表達(dá)載體，以pet-28a(+)為骨架載體，在其t7啟動子下游插入上述的基因，且所述融合蛋白的c末端編碼6*his標(biāo)簽。
19、進(jìn)一步地，還包括用于為所述p450融合蛋白提供電子傳遞的氧化還原伴侶重組載體；所述氧化還原伴侶重組載體以petduet-1為骨架載體，在其mcs-1的t7啟動子下游插入第一氧化還原伴侶基因，在mcs-2的t7啟動子下游插入第二氧化還原伴侶基因；
20、所述第一氧化還原伴侶基因與第二氧化還原伴侶基因?yàn)橐韵陆M合之一：
21、組合1：thcd基因與thcc基因；
22、組合2：adr基因與adx基因；
23、組合3：acic基因與acib基因；
24、組合4：bmcpr基因與fdx2基因。
25、進(jìn)一步地，所述氧化還原伴侶重組載體中，各基因均經(jīng)大腸桿菌密碼子偏好性優(yōu)化，且編碼的蛋白c末端均帶有6*his標(biāo)簽；所述氧化還原伴侶重組載體為petduet1-thcd/thcc、petduet1-adr/adx、petduet1-acic/acib或petduet1-bmcpr/fdx2。
26、進(jìn)一步地，所述氧化還原伴侶基因的來源及genbank登錄號如下：
27、thcd基因、thcc基因：來源于紅城紅球菌（rhodococcuserythropolis），登錄號均為u17130.1；
28、adr基因：來源于家牛（bostaurus），登錄號為xm_010856133.1；
29、adx基因：來源于家牛（bostaurus），登錄號為nm_181011.2；
30、bmcpr基因、fdx2基因：來源于巨大芽孢桿菌（bacillusmegaterium），登錄號均為cp009920.1。
31、本發(fā)明還提供一種基因工程菌，所述工程菌為以下任一方式構(gòu)建獲得的陽性克隆株：
32、方式1：將上述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌e.colibl21(de3)中，經(jīng)抗性篩選獲得；
33、方式2：將上述的含氧化還原伴侶重組載體的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌e.colibl21(de3)中，經(jīng)抗性篩選獲得；
34、方式3：將上述的重組表達(dá)載體、氧化還原伴侶重組載體與petduet1-gdh質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)化至大腸桿菌e.colibl21(de3)中，經(jīng)抗性篩選獲得；
35、其中，所述petduet1-gdh質(zhì)粒是以petduet-1為骨架載體，在其mcs-1的t7啟動子下游插入經(jīng)大腸桿菌密碼子優(yōu)化的葡萄糖脫氫酶基因gdh，所述葡萄糖脫氫酶基因的genbank登錄號為j04805.1，且葡萄糖脫氫酶基因的c末端編碼6*his標(biāo)簽；
36、所述基因工程菌能表達(dá)p450融合蛋白，或同時表達(dá)所述p450融合蛋白與對應(yīng)的氧化還原伴侶蛋白，或同時表達(dá)所述p450融合蛋白、對應(yīng)的氧化還原伴侶蛋白及葡萄糖脫氫酶基因。
37、p450融合蛋白、重組載體或基因工程菌在高效合成骨化二醇中的應(yīng)用。
38、與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：
39、（1）本發(fā)明通過系統(tǒng)篩選，確定了來源于不動桿菌的acic/acib氧化還原伴侶系統(tǒng)與vdhm3?p450酶具有最佳適配性，其催化活性（37?u）遠(yuǎn)高于其他測試系統(tǒng)，且對目標(biāo)產(chǎn)物骨化二醇的選擇性高達(dá)95%，大幅減少了副產(chǎn)物的生成，提高了產(chǎn)物的純化效率與收率。
40、（2）本發(fā)明創(chuàng)新性地將p450酶（vdhm3）與最優(yōu)氧化還原伴侶（acic/acib）通過理性設(shè)計的連接肽進(jìn)行融合表達(dá)。通過對12種不同性質(zhì)連接子的篩選，獲得了最優(yōu)連接子（l3，序列為ggggsggggsggggsggggs），使得融合蛋白vdhm3rdp的催化活性達(dá)到原始vdhm3的1.3倍。該融合設(shè)計縮短了酶與輔酶間的電子傳遞距離，降低了傳遞損耗，從而顯著提高了催化效率。
41、（3）本發(fā)明所述的全能型p450融合蛋白將多酶系統(tǒng)的功能整合于單一多肽鏈上，避免了傳統(tǒng)方法中p450酶與氧化還原伴侶需要分別表達(dá)、純化后再進(jìn)行復(fù)配的復(fù)雜流程。這簡化了生產(chǎn)步驟，提高了工藝穩(wěn)定性，并有利于實(shí)現(xiàn)規(guī)模化制備。
42、（4）本發(fā)明通過構(gòu)建基因工程菌，將全能型p450融合蛋白與葡萄糖脫氫酶（gdh）在同一菌體內(nèi)共表達(dá)。gdh可利用廉價的葡萄糖連續(xù)再生反應(yīng)所需的nadh/nad+，驅(qū)動催化循環(huán)持續(xù)進(jìn)行。該體系在19小時內(nèi)可將10?mm維生素d3轉(zhuǎn)化為8.47?mm骨化二醇，轉(zhuǎn)化率達(dá)84.70%，無需外源添加昂貴的輔酶，有效降低了生產(chǎn)成本。
43、（5）本發(fā)明不僅提供了最優(yōu)的融合蛋白構(gòu)件（vdhm3-l3-acic-gsgsgh-acib），還公開了包含多種氧化還原伴侶選項(xiàng)和連接子序列的載體系統(tǒng)與構(gòu)建方法。這為針對不同底物或工藝需求的p450酶系改造提供了可選的模塊化工具，具有廣泛的應(yīng)用潛力和擴(kuò)展性。