本發明屬于醫用材料，具體涉及重組人源化iii型膠原蛋白、制備方法與應用。
背景技術：
1、公開該背景技術部分的信息僅僅旨在增加對本發明的總體背景的理解，而不必然被視為承認或以任何形式暗示該信息構成已經成為本領域一般技術人員所公知的現有技術。
2、膠原蛋白作為細胞外基質的主要結構蛋白，廣泛存在于皮膚、骨骼、肌腱、韌帶、軟骨以及幾乎所有組織與器官中，且廣泛應用于創面修復與組織工程等領域。其天然的三重螺旋結構及生物活性為其成為創面敷料、化妝品、組織工程和醫療器械等領域的重要基礎材料提供了理想基礎。目前生產主要依賴動物組織提取，易引起活性喪失及生物安全風險。
3、重組蛋白技術為獲得高安全性、可定制化的人源膠原蛋白開辟了新路徑，但仍需進一步提升其與細胞的特異性結合能力及在臨床應用中的功能性。開發具有增強細胞粘附性能的新型膠原蛋白材料，成為改進現有創面敷料等產品的重要方向。
技術實現思路
1、為了解決現有技術的不足，本發明的目的是提供重組人源化iii型膠原蛋白、制備方法與應用。本發明以人體ⅲ型膠原蛋白的完整氨基酸序列為基礎，系統篩選并確定其具有關鍵生物活性的核心功能序列。基于該序列特征，通過理性設計與定向重復構建，獲得了一系列結構明確、功能增強的重組人源化iii型膠原蛋白。本發明提供的重組人源化iii型膠原蛋白是基于生物信息學優化設計的基因序列，確保了其能夠形成穩定的三重螺旋結構，完整保留了天然膠原蛋白特有的功能域，其在細胞增殖、粘附等生物功能方面顯著優于因傳統提取工藝而導致結構受損的動物源膠原蛋白。
2、為了實現上述目的，本發明的技術方案為：
3、本發明的第一個方面，提供一種重組人源化iii型膠原蛋白，所述重組人源化iii型膠原蛋白的氨基酸序列為seq?id?no.2-6中的任意一種。
4、經過試驗表明，本發明提供的上述重組人源化iii型膠原蛋白顯著增強了其與細胞的特異性粘附能力，相較于傳統提取方法，該重組蛋白完全規避了動物源材料的病原體污染風險，并有效保持了膠原蛋白的天然生物活性與穩定性。
5、本發明的第二個方面，提供一種編碼第一個方面所述的重組人源化iii型膠原蛋白的核酸片段。
6、在本發明的一些實施例中，所述核酸片段的核苷酸序列為seq?id?no.7-11中的任意一種。此處所示序列在其n端不包含起始密碼子（如atg）編碼的氨基酸（如甲硫氨酸（met））。本領域技術人員理解，在通過基因工程制備蛋白的過程中，由于起始密碼子的作用，所產生的多肽鏈第一位經常為起始密碼子編碼的氨基酸（如met）。本發明的重組人源化iii型膠原蛋白的核酸片段不僅囊括在其n末端不包含起始密碼子編碼的氨基酸（如met）的氨基酸序列，也囊括在其n末端包含起始密碼子編碼的氨基酸（如met）的氨基酸序列。因此，在上述氨基酸序列的n端進一步包含起始密碼子編碼的氨基酸（如met）的序列也在本發明的保護范圍內。
7、本發明的第三個方面，提供一種重組表達載體，包括載體質粒和第二個方面所述的核酸片段。
8、本發明所述的重組表達載體通過將上述核酸片段有效地連接到載體質粒上獲得。具體地，所述重組表達載體可通過單片段擴增獲得重組人源化iii型膠原蛋白的編碼區基因片段，再與載體質粒連接獲得；亦可通過將編碼上述重組人源化iii型膠原蛋白的基因連接到載體質粒上獲得。
9、在本發明的一些實施例中，所述載體質粒為pet28a質粒。本發明采用上述質粒更利于其在工程菌中的表達。
10、本發明的第四個方面，提供一種重組宿主細胞，所述重組宿主細胞含有第二個方面所述的核酸片段或第三個方面所述的重組表達載體。
11、本發明所述的重組宿主細胞可通過化學轉化或電擊法將重組表達載體導入宿主細胞中獲得。
12、本發明所述的重組宿主細胞可以為原核細胞或真核細胞，具體地，可以為細菌細胞、真菌細胞或植物細胞中的任意一種或幾種，更為具體地，包括但不限于大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、乳酸菌、釀酒酵母或鏈霉菌等。
13、為了獲得目標重組宿主細胞，需要通過篩選陽性克隆驗證。所述篩選可基于抗生素篩選、藍白斑篩選、pcr篩選、酶切篩選或測序篩選等，在此不做限定，可根據實際情況選擇。
14、本發明提供的上述核酸片段、重組表達載體或重組宿主細胞的目的，均是為了表達上述重組人源化iii型膠原蛋白。誘導重組宿主細胞表達重組人源化iii型膠原蛋白時，可基于異丙基-β-d-硫代半乳糖苷（iptg）誘導、ph/溫度誘導、酯類化合物誘導或金屬離子誘導等，在此不做限定，可根據重組表達載體及工程菌特性靈活選擇。
15、本發明的第五個方面，提供一種第一個方面所述的重組人源化iii型膠原蛋白的制備方法，包括：
16、構建第三個方面所述的重組表達載體；
17、將所述重組表達載體轉入細胞中進行表達，產生所述的重組人源化iii型膠原蛋白。
18、重組宿主細胞表達重組人源化iii型膠原蛋白后，可通過對重組宿主細胞進行超聲破碎及純化獲得。其中，純化包括沉淀及親和層析處理。具體地，所述親和層析可以是陰離子交換層析、鎳親和層析、谷胱甘肽親和層析或金屬螯合層析等，在此不做限定，可根據蛋白質特性選擇。
19、本發明的第六個方面，提供一種第一個方面所述的重組人源化iii型膠原蛋白在生物醫用材料中的應用。
20、在本發明的一些實施例中，所述生物醫用材料包括膠原蛋白止血棉、手術縫合線、傷口敷料中的任意一種或幾種。本發明所述的重組人源化iii型膠原蛋白用作傷口敷料時，能夠促進細胞粘附，生物活性高。
21、本發明的第七個方面，提供一種生物醫用材料，包括以下(1)~(5)中任意一種或其組合：
22、(1)第一個方面所述的重組人源化iii型膠原蛋白；
23、(2)第二個方面所述的核酸片段；
24、(3)第三個方面所述的重組表達載體；
25、(4)第四個方面所述的重組宿主細胞。
26、本發明的有益效果為：
27、本發明提供了一種新型重組人源化iii型膠原蛋白，通過分子設計優化了其結構與功能域，顯著增強了與細胞的特異性粘附能力。相較于傳統提取方法，該重組蛋白的氨基酸序列與人體天然蛋白高度一致，完全避免了動物源提取過程中可能存在的病原體、朊病毒等生物安全風險，同時具有更低的免疫原性，顯著提升了產品的臨床使用安全性。且該蛋白有效保持了膠原蛋白的天然生物活性與穩定性。作為創面敷料應用時，該材料能夠高效促進細胞遷移、鋪展與增殖，加速組織再生與傷口愈合，同時具備優異的生物相容性、可調控降解性及低免疫原性，為組織工程和醫療器械領域提供了性能更優、安全性更高的解決方案。
28、本發明通過多級純化方式，可高效去除宿主雜蛋白、核酸及內毒素，最終獲得的重組膠原蛋白產物純度可達95%以上，滿足化妝品及醫療器械等產品的嚴格質控要求。
1.重組人源化iii型膠原蛋白，其特征在于，其氨基酸序列為seq?id?no.2-6中的任意一種。
2.編碼權利要求1所述的重組人源化iii型膠原蛋白的核酸片段。
3.如權利要求2所述的核酸片段，其特征在于，其核苷酸序列為seq?id?no.7-11中的任意一種。
4.重組表達載體，其特征在于，包括載體質粒和權利要求2或3所述的核酸片段。
5.如權利要求4所述的重組表達載體，其特征在于，所述載體質粒為pet28a質粒。
6.重組宿主細胞，其特征在于，所述宿主細胞含有權利要求2或3所述的核酸片段或權利要求4或5所述的重組表達載體。
7.一種權利要求1所述的重組人源化iii型膠原蛋白的制備方法，其特征在于，包括：
8.一種權利要求1所述的重組人源化iii型膠原蛋白在生物醫用材料中的應用。
9.如權利要求8所述的應用，其特征在于，所述生物醫用材料包括膠原蛋白止血棉、手術縫合線、傷口敷料中的任意一種或幾種。
10.一種生物醫用材料，其特征在于，包括以下(1)~(5)中任意一種或其組合：