本發明屬于生物，具體涉及對稱切口酶介導的先導編輯器和編輯系統及其應用。
背景技術：
1、先導編輯器（prime?editor,?pe）是最為先進的二代crispr/cas9基因組編輯技術之一，可實現任意類型的單堿基替換以及短dna片段的插入和刪除。先導編輯器由cas9n(cas9?nickase,?cas9?切口酶)-h840a突變體、mmlv逆轉錄酶以及pegrna組成，其中cas9n負責介導雙鏈dna的解鏈和非靶向鏈的切割，進而誘導結合引物的產生，隨后pegrna中的pbs（prime?binding?sequence）與引物結合，并借由逆轉錄酶的作用引導逆轉錄反應產物的生成，最后經過真核細胞的dna修復機制插入目的突變。目前pe已經由最初的pe2/3發展至現有的pe6/7版本，pe3相較于pe2引入了一條引導靶向鏈切割的grna，可促進編輯效率的提升；pe4/5在既往基礎上引入了抑制細胞mmr（mismatch?repair）修復的負向調控因子mlh1dn，進一步優化現有pe的編輯效率；pe2max將mmlv替換至高效率的逆轉錄酶截斷體，并通過優化核定位信號及cas9的酶切活性實現pe的再優化；pe7max在pe2max的基礎上引入了la蛋白，實現了pe的進一步優化（yan?j?,?oyler-castrillo?p?,?ravisankar?p?,etal.improving?prime?editing?with?an?endogenous?small?rna-binding?protein[j].nature,?2024,?628(8008):34.doi:10.1038/s41586-024-07259-6.）。雖然pe的編輯效率已經實現大幅提升，但pe的編輯效率以及indel產物比例仍有優化空間。研究人員還通過誘導切口末端降解的cas9切口定位松弛突變來降低降低indel產物比例，但編輯效率較低（chauhan?v?p?,?sharp?p?a?,?langer?r?.engineered?prime?editors?with?minimalgenomic?errors[j].nature,?2024.?doi:10.1101/2024.08.02.606370.）。
2、pe目前的編輯效率仍有優化空間，grna和靶向鏈的反復結合會提升indel比例，源于pe在真核細胞中的修復機制不清晰。
3、因此，開發一種增強pe編輯效率，降低indel的新型pe編輯器，具有重要意義。
技術實現思路
1、為了解決現有技術存在的問題，本發明提供了一個新的pe編輯器pace?(phasedcas9?nickase?editing)-pe，該編輯器是一個整合了由單個單向導rna引導的cas9n-d10a和cas9n-h840a的異源切口酶平臺。在pace-pe架構中，將cas9n-d10a與pe7max整合，進一步拓展了這一能力，實現了高效且可擴展的先導編輯，并顯著減少了副產物。pace-pe由cas9n-h840a突變體，mmlv逆轉錄酶，la蛋白，cas9n-d10a突變體以及pegrna構成，基本原理為協同cas9n-d10a和cas9n-h840a的切口酶活性，在pegrna引導下產生方向可控的雙鏈切口，從而加速pe編輯產物的修復，提升編輯效率。
2、一方面，本發明提供一種對稱切口酶介導的先導編輯器，所述先導編輯器為整合了由單個單向導rna引導的cas9切口酶1和cas9切口酶2平臺，包括兩種不同cas9切口酶、mmlv逆轉錄酶、la蛋白以及pegrna構成。其中，cas9切口酶1用于實現非靶向鏈的切割，cas9切口酶2用于實現靶向鏈切割，兩者切割的切口是對稱的。由于只采用一個grna，兩個切口酶不可能同時結合靶向位置，因而兩種切口酶非同步切割而產生的對稱切口。
3、具體地，所述cas9切口酶包括cas9切口酶1和cas9切口酶2，所述cas9切口酶1選自以下任一或幾種：
4、（i）切口酶1為cas9n-h840a突變體，其氨基酸序列與野生型cas9的氨基酸序列相比在第840位氨基酸位點處存在突變，所述cas9n-h840a突變體的氨基酸序列如seq?id?no：1所示；
5、（ii）切口酶1為cas9n-h840a-s55e-i122d-i170n-d947g突變體，其氨基酸序列與野生型cas9的氨基酸序列相比在第840位、第55位、第122位、第170位和/或第947位氨基酸位點處存在突變，所述cas9n-h840a-s55e-i122d-i170n-d947g突變體的氨基酸序列為seqid?no：5所示；
6、所述cas9切口酶2選自以下任一或幾種：
7、（a）切口酶2為cas9n-d10a突變體，其氨基酸序列與野生型cas9的氨基酸序列相比在第10位氨基酸位點處存在突變，所述cas9-d10a突變體的氨基酸序列為如seq?id?no：4所示；
8、（b）切口酶2為cas9n-d10a-n803p-d861s，其的氨基酸序列與野生型cas9的氨基酸序列相比在第10位、第803位和/或第861位氨基酸位點處存在突變，所述cas9n-d10a-n803p-d861s突變體的氨基酸序列為如seq?id?no：6所示。
9、本發明中，氨基酸殘基可以用單字母表示，也可以用三字母表示，例如：丙氨酸(ala，a)，纈氨酸(val，v)，甘氨酸(gly，g)，亮氨酸(leu，l)，谷酰胺酸(gln，q)，苯丙氨酸(phe，f)，色氨酸(trp，w)，酪氨酸(tyr，y)，天冬氨酸(asp，d)，天冬酰胺(asn，n)，谷氨酸(glu，e)，賴氨酸(lys，k)，甲硫氨酸(met，m)，絲氨酸(ser，s)，蘇氨酸(thr，t)，半胱氨酸(cys，c)，脯氨酸(pro，p)，異亮氨酸(ile，i)，組氨酸(his，h)，精氨酸(arg，r)。
10、如本文所用，術語“h840a”表示第840位的氨基酸h變為氨基酸a，“cas9n-h840a”表示cas9蛋白第840位的氨基酸h變為氨基酸a，例如“cas9n-h840a-s55e-i122d-i170n-d947g”表示cas9蛋白第840位的氨基酸h變為氨基酸a第55位的氨基酸s變為氨基酸e、第122位的氨基酸i變為氨基酸d、第170位的氨基酸i變為氨基酸n同時第947位的氨基酸d變為氨基酸g，以此類推。突變體位點相對野生型氨基酸序列發生突變。
11、具體地，所述mmlv逆轉錄酶的氨基酸序列如seq?id?no:2所示，所述la蛋白的氨基酸序列如seq?id?no:3所示。
12、一方面，本發明提供了一種所述的先導編輯器的構建方法，包括如下步驟：
13、1）分別構建包含cas9切口酶1的編輯器pe7max和cas9切口酶2；
14、2）通過酶切酶連構建grna，再經pcr和同源重組構建pegrna；
15、3）將pe7max與pegrna混合后加入cas9切口酶2，得到pace-pe編輯器。
16、具體地，構建grna的酶切酶連體系包含ec3il酶、t4連接酶、t4連接酶緩沖液和bsa，所述pe7max:pegrna:cas9切口酶2=（2-6）：（1-2）：（1-1.5）。
17、一方面，本發明提供了一種對稱切口酶介導的先導編輯系統，包含所述的先導編輯器。
18、一方面，本發明提供了一種基因編輯的方法，所述方法為非疾病診斷和治療目的的方法，將所述的先導編輯器、或所述的先導編輯系統對細胞進行轉染，轉染過程中加入opti培養基和pei，使dna:pei質量比為1：2~10，轉染結束后收集細胞沉淀，得到基因編輯后的細胞；優選地，dna:pei質量比為1：3~5；優選地，所述基因編輯為真核細胞中的基因編輯，例如hek293t細胞。
19、具體地，所述轉染前在24孔板中按照6×104-10×104的密度進行鋪板，培養至細胞密度達到60%-80%進行轉染，轉染6h后需要換液，轉染70-80h后收集細胞沉淀；優選地，按照7×104-8×104的密度鋪板，轉染70-75h后收集細胞沉淀。
20、一方面，本發明提供所述的先導編輯器、或所述的先導編輯系統在提高基因組先導編輯效率中的應用。
21、另一方面，本發明提供所述的先導編輯器、或所述的先導編輯系統在降低基因組先導編輯過程中插入缺失副產物比例中的應用。
22、與現有技術相比，本發明具有以下有益效果：本發明構建的pace-pe編輯器整合cas9n-d10a與pe7max，協同兩種cas9切口酶活性產生可控雙鏈切口，顯著提升先導編輯效率，在多個位點將編輯效率從1.9-22.4%提升至14.6-68.5%，且未顯著增加插入缺失副產物。經蛋白質語言優化得到的enpace-pe，在多個內源性位點進一步提升編輯效率，同時保持對插入缺失和支架副產物的高編輯特異性。本發明突破現有pe編輯器修復機制不清晰、grna反復結合導致indel比例高的技術瓶頸，無需嘌呤霉素篩選即可實現高效編輯，編輯器架構可擴展，為基因組編輯提供了高效、特異、低副產物的新型工具，在生物技術研究和基因編輯應用領域具有重要實用價值。