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        分相切口酶介導的先導編輯器和編輯系統及其應用

        文檔序號:45762447發布日期:2026-06-10 00:52閱讀:4來源:國知局
        技術特征:

        1.一種分相切口酶介導的先導編輯器,其特征在于,所述先導編輯器為整合了由單個單向導rna引導的cas9切口酶1和cas9切口酶1平臺,包括cas9切口酶1和cas9切口酶2、mmlv逆轉錄酶、la蛋白以及pegrna構成;其中,cas9切口酶1用于實現非靶向鏈的切割,cas9切口酶2用于實現靶向鏈切割,兩者切割的切口是對稱的;所述cas9切口酶1選自以下任一或幾種:

        2.根據權利要求1所述的先導編輯器,其特征在于,所述mmlv逆轉錄酶的氨基酸序列如seq?id?no:2所示,所述la蛋白的氨基酸序列如seq?id?no:3所示。

        3.權利要求1或2所述的先導編輯器的構建方法,其特征在于,包括如下步驟:

        4.根據權利要求3所述的方法,其特征在于,構建grna的酶切酶連體系包含ec3il酶、t4連接酶、t4連接酶緩沖液和bsa,所述pe7max:pegrna:cas9切口酶2的質量比=(2-6):(1-2):(1-1.5)。

        5.一種分相切口酶介導的先導編輯系統,其特征在于,包含權利要求1或2任一所述的先導編輯器。

        6.一種真核細胞中基因編輯的方法,其特征在于,所述方法為非疾病診斷和治療目的的方法,將權利要求1或2所述的先導編輯器、或權利要求5所述的先導編輯系統對細胞進行轉染,轉染過程中加入opti培養基和pei,使dna:pei質量比為1:2~10,轉染結束后收集細胞沉淀,得到基因編輯的細胞。

        7.根據權利要求6所述的方法,其特征在于,dna:pei質量比為1:3~5;所述真核細胞是hek293t細胞;

        8.權利要求1或2所述先導編輯器或權利要求5所述先導編輯系統在提高基因組先導編輯效率中的應用。

        9.權利要求1或2所述先導編輯器或權利要求5所述先導編輯系統在降低基因組先導編輯過程中插入缺失副產物比例中的應用。


        技術總結
        本發明公開了一種分相切口酶介導的先導編輯器和編輯系統及其應用,屬于生物技術領域。該編輯器通過整合Cas9?D10A與PE7max,由Cas9?H840A突變體、MMLV逆轉錄酶、LA蛋白、Cas9?D10A突變體和pegRNA構成,通過協同兩種Cas9切口酶活性,在靶位點產生空間對稱且時間分相的DNA切口,從而加速編輯產物修復。同時,通過蛋白質語言優化篩選出Cas9關鍵突變位點,對編輯器進一步優化。結果顯示,該編輯器將編輯效率顯著提升,優化后的編輯器進一步提升內源性位點編輯效率,且均未顯著增加插入缺失,還保持對支架副產物的編輯特異性,解決了現有PE編輯效率不足、indel比例高的問題。

        技術研發人員:楊超,郝繼輝,方慶霄,王喆
        受保護的技術使用者:天津市腫瘤醫院(天津醫科大學腫瘤醫院)
        技術研發日:
        技術公布日:2026/6/9
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