一種應用于蛋白免疫印跡的快速封閉方法

本發明涉及蛋白檢測領域，具體是一種應用于蛋白免疫印跡的快速封閉方法。

背景技術：

1、western?blotting（wb）又稱免疫印跡（immunoblotting），是根據抗原抗體的特異性結合檢測復雜樣品中的某種蛋白的方法。抗原-抗體是免疫球蛋白分子上的抗原結合簇與抗原分子上的抗原決定簇相互吸引以及多種分子間的引力參與發生的。這種抗原抗體的結合所涉及的反應，是分子表面的離子鍵，疏水鍵等。抗原-抗體的結合是可逆的。抗原抗體之間發生非特異性結合，印跡膜曝光后就會出現非特異性條帶以及黑暗的高背景。

2、如果要消除背景的非特異性染色，當然使用特異性高、效價高的第一抗體是最重要的條件以及合適的二抗濃度。除此以外，印跡膜是否被成功封閉掉非特異性結合位點也是至關重要。最有效方法是在用第一抗體前加制備第二抗體動物之非免疫血清(1:5~1:20)封閉印跡膜上帶電荷基團而除去與第一抗體非特異性結合。現wb實驗中經常使用的封閉試劑有脫脂牛奶粉?(nonfat?dry?milk;?nfdm)，牛血清蛋白，明膠，豆奶粉以及pvp,?pva,casein,?sodium?dodecyl?sulphate，在常溫（rt）下進行封閉1-2h后，均能提高抗原抗體反應的高特異性和敏感性。但是也有文獻報道傳統的封閉劑中含bsa和酪蛋白，封閉效果差，容易產生較多的雜帶，如：bsa和酪蛋白中均有少量的抗體殘留，會導致抗原/抗體之間的交叉反應，產生高背景，雜帶較多或使得本底水平增高

3、而且,?進行凝膠電泳，轉膜直至最后曝光，這一過程非常耗費時間和金錢，因此我們必須縮短封閉時間，提高科研人員工作效率。然而,?國外的快速封閉液pierce?fastblocking?buffer?(#37575)?價格昂貴，那么如何研發出物美價廉的封閉液、縮短封閉處理的時間成為我們需要思考的問題。

技術實現思路

1、本發明的目的是為了克服現有技術存在的缺點和不足，而提供一種應用于蛋白免疫印跡的快速封閉方法，本發明所采取的技術方案如下：

2、首先制備一種應用于蛋白免疫印跡的封閉液，其制備方法為：

3、三羥甲基氨基甲烷(tris)?0.12%-0.22%(質量/體積)；

4、edta（乙二胺四乙酸）?0.037%-0.047%?(質量/體積)；

5、tween?20?0.005%-0.01%(體積/體積)；

6、將上述溶液用ddh2o溶解得到混合液，調ph值9.0~9.5后，室溫（rt）可保存數月；在使用前用上述混合液配置質量/體積比為5-10%脫脂牛奶粉后，得到快速封閉液，現配現用。

7、上述快速封閉方法為：將電轉移蛋白質的nc（硝酸纖維素）印跡膜用tbst漂洗一次,約5min；而后將快速封閉液轉移到50ml離心管后，再將其放入水里進行加熱（~95℃左右）后，然后將nc膜轉移到盛有~95℃封閉液的50ml離心管，經過5min-?10min封閉后就可以取出nc膜;?再對nc膜繼續用tbst漂洗5min?x2次。最后將按照常規程序繼續進行wb操作；上述tbst?(ph~7.3)?中含有?tris-hcl，nacl，tween20?這三種物質，是做wb中常用的一種緩沖溶液。

8、本發明的有益效果如下：本發明的快速封閉方法是用三羥甲基氨基甲烷(tris)、edta、tween?20將脫脂牛奶粉配置成一定濃度后，然后再將電轉移后的印跡膜放入到約95℃的快速封閉液中，繼續封閉5-10min，取出，再進行后續實驗；本發明提供的快速封閉方法可以顯著性縮短科研人員免疫印跡操作的時間，并且印跡膜曝光后的磷酸化蛋白或非磷酸化蛋白結果依然可靠；另外，本快速封閉液可以通過使用更少的緩沖液和其他有價值的試劑來降低實驗成本，因此，本發明提供的快速封閉方法在不同條件下的wb中有廣泛的應用前景。

1.一種應用于蛋白免疫印跡的快速封閉方法，其特征在于，其步驟為：

2.根據權利要求1所述的一種應用于蛋白免疫印跡的快速封閉方法，其特征在于，所述快速封閉液各組分為：

3.根據權利要求1所述的一種應用于蛋白免疫印跡的快速封閉方法，其特征在于:所述隔水加熱的快速封閉液的溫度為90-95℃。

4.根據權利要求1所述的一種應用于蛋白免疫印跡的快速封閉方法，其特征在于:所述的封閉一段時間為5-10min。