用冰城鏈霉菌制備的新化合物及制備方法

專利名稱：用冰城鏈霉菌制備的新化合物及制備方法
技術領域：
本發明涉及的是一種化合物，具體地說是一種α系列米爾貝霉素。本發明還涉及這種化合物的制備方法。
背景技術：
目前，國內外應用廣泛的大環內酯類農用抗生素阿維菌素屬雙糖類化合物，國內年產量的50％用于出口。阿維菌素含avermectin B1a≥80％和avermectinB1b≤20％，對植食性螨類有特效，由美國Merck公司開發并生產，具有觸殺和胃毒作用，有很弱的內吸性。能防治桔緣螨、普通紅葉螨、榆全爪螨和棉紅蜘蛛等害螨，主要用于防治棉花、柑桔、堅果、蔬菜、土豆、觀賞植物等作物上的害螨，對天敵安全，對能動期的害螨都有活性，但其對胚胎未發育的初產卵無毒殺作用，只對胚胎已發育的后期卵有較強殺卵活性。

發明內容
本發明的目的是提供一種對螨蟲和其他損害植物的昆蟲具有很高的抑制活性的用冰城鏈霉菌制備的新化合物-α型米爾貝霉素。
本發明的另一個目的是提供冰城鏈霉菌制備的新化合物-α型米爾貝霉素的制備方法。
本發明的化合物的結構式為
其中R1可以是CH3或者是CH2CH3；R2可以是 或者是 ；R3可以是 或者是H。
其具體組合結構可以為 本發明的產品是采用這樣的方法來制備的(1)發酵菌株發酵菌種的分類命名為冰城鏈霉菌(Streptomyces bingchengsis sp.nov)，于2006年06月12日保藏于“中國生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，其保藏登記號為CGMCC NO.1734。并在NCBI登陸16S rDNA序列，序列號為DQ449953。
(2)斜面培養將0.4％的蔗糖，0.2％的酵母粉，0.5％的麥芽提取物，0.1％和脫脂奶粉，溶于水中，用1mol NaOH調pH至7.0，加2.0％的瓊脂，再調pH至7.2后121℃滅菌30min，28℃培養7-8天，用1ml無菌水將斜面的冰城鏈霉菌孢子洗下并制成孢子懸浮液。
(3)種子培養培養基(蔗糖1％；蛋白凍0.4％；K2HPO40.05％。用250ml的三角瓶每瓶分裝25ml，將1ml孢子懸浮液加入25ml種子培養基中，置于搖床上28℃，250rpm培養42h然后將培養基(蔗糖8％；大豆餅粉1％；酵母粉0.2％；牛肉膏0.1％；CaCO30.3％；K2HPO40.3％，MgSO4·7H2O 0.1％，FeSO4·7H2O 0.005％；調節pH至7.2)每100ml分裝于1L三角瓶，121℃滅菌30min，接種8ml含孢子懸浮液的種子培養基，至于搖床28℃，250rpm培養8天。
(4)發酵液處理50L發酵液經200目篩網過濾，并且用水清洗發酵液，發酵液和清洗用的水全都棄掉，用30升甲醇浸提過濾后得到的濾渣，通過減壓蒸餾的方法最后將甲醇溶液濃縮到大約2升，再將濃縮液用相同體積的EtOAc浸提3次，將得到的EtOAc相，減壓蒸餾會產生25g油狀物質。將所得油狀物上硅膠柱(粒徑200～300目)進行層析，分別用石油醚∶丙酮(95∶5-50∶50)洗脫，蒸餾得到不含A3和A4的粗制品10g。將粗制品分別用石油醚∶丙酮(9∶1-3∶1)兩種洗脫液進行洗脫，得到了五個組分，將組分四上RP-C18硅膠柱進行層析，用甲醇∶水＝70∶30-85∶15二種洗脫液進行洗脫，會得到化合物1(20mg)和化合物2(11mg)。將組分三上RP-C18硅膠柱進行層析，用甲醇∶水(70∶30-95∶5)洗脫得到化合物3 22mg。
本發明的化合物具有強的殺螨活性，能殺滅，例如寄生在果樹、蔬菜和花上的四爪螨屬、全爪螨屬和銹螨屬的成螨和卵。它們對于寄生于動物身上的硬蜱科、皮刺螨科和疥螨科也有活性。它們還能殺滅外寄生物，如寄生于動物和鳥，尤其是家畜和家禽身上的狂蠅屬、綠蠅屬、皮蠅屬、胃蠅屬，虱和蚤；家庭昆蟲，如蟑螂和家蠅；以及農業和園藝地里的各種有害昆蟲，如蚜蟲和鱗翅目幼蟲。它們也能有效殺滅土壤中的螻屬。它們也能有效殺滅以下種類的昆蟲鞘翅目，同翅目，異翅目，雙翅目，纓翅目，直翅目，虱目，蚤目，食毛目，纓尾目，等翅目，膜翅目等。
本發明的化合物同樣可用以控制其他會損害植物的昆蟲，尤其通過吃植物而使之損害的昆蟲。這些化合物可用以保護觀賞植物和生產性植物，尤其棉花(如殺滅煙芽夜蛾)，以及蔬菜作物(如殺滅馬鈴薯甲蟲和桃蚜)和水稻作物(如殺滅二化螟和稻虱)。
本發明的新化合物不但具有很好的殺死成蟲的效果，對蟲卵藥效也很高，因此，更具開發潛力。


圖1米爾貝α23的inv4gplrndqf譜圖；圖2米爾貝α23的cosygpqf譜圖；圖3米爾貝α23的inv4gplrndqf譜圖；圖4米爾貝α23的invietgp譜圖；圖5米爾貝α23的ms譜圖；圖6米爾貝α23的zgdc譜圖；圖7米爾貝α24的noesyph譜圖；圖8米爾貝α24的invietgp譜圖；圖9米爾貝α24的cosygpqf譜圖；圖10米爾貝α24的zgdc譜圖；
圖11米爾貝α24的zgdc譜圖米爾貝α24的zg30譜圖；圖12米爾貝α24的ms譜圖；圖13米爾貝α24的inv4gplrndqf譜圖；圖14米爾貝α25的noesyph譜圖；圖15米爾貝α25的inv4gplrndqf譜圖；圖16米爾貝α25的invietgp譜圖；圖17米爾貝α25的zgdc譜圖；圖18米爾貝α25的zg30譜圖。
具體實施例方式
下面結合實施例，對本發明作詳細說明。
實施例1化合物制備1.發酵(1)發酵菌株發酵菌種的分類命名為冰城鏈霉菌(Streptomyces bingchengsis sp.nov)，于2006年06月12日保藏于“中國生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心”，其保藏登記號為CGMCC NO.1734。并在NCBI登陸16S rDNA序列，序列號為DQ449953(2)斜面培養將0.4％的蔗糖，0.2％的酵母粉，0.5％的麥芽提取物，0.1％和脫脂奶粉，溶于水中，用1mol NaOH調pH至7.0，加2.0％的瓊脂，再調pH至7.2后121℃滅菌30min，28℃培養7-8天，用1ml無菌水將斜面的冰城鏈霉菌孢子洗下并制成孢子懸浮液。
(3)種子培養培養基(蔗糖1％；蛋白凍0.4％；K2HPO40.05％。用250ml的三角瓶每瓶分裝25ml，將1ml孢子懸浮液加入25ml種子培養基中，置于搖床上28℃，250rpm培養42h然后將培養基(蔗糖8％；大豆餅粉1％；酵母粉0.2％；牛肉膏0.1％；CaCO30.3％；K2HPO40.3％，MgSO4·7H2O 0.1％，FeSO4·7H2O 0.005％；調節pH至7.2)每100ml分裝于1L三角瓶，121℃滅菌30min，接種8ml含孢子懸浮液的種子培養基，至于搖床28℃，250rpm培養8天。
(4)發酵液處理50L發酵液經200目篩網過濾，并且用水清洗發酵液，發酵液和清洗用的水全都棄掉，用30升甲醇浸提過濾后得到的濾渣，通過減壓蒸餾的方法最后將甲醇溶液濃縮到大約2升，再將濃縮液用相同體積的EtOAc浸提3次，將得到的EtOAc相，減壓蒸餾會產生25g油狀物質。將所得油狀物上硅膠柱(粒徑200～300目)進行層析，分別用石油醚∶丙酮(95∶5-50∶50)洗脫，蒸餾得到不含A3和A4的粗制品10g。將粗制品分別用石油醚∶丙酮(9∶1-3∶1)兩種洗脫液進行洗脫，得到了五個組分，將組分四上RP-C18硅膠柱進行層析，用甲醇∶水＝70∶30-85∶15二種洗脫液進行洗脫，會得到化合物1(20mg)和化合物2(11mg)。將組分三上RP-C18硅膠柱進行層析，用甲醇∶水(70∶30-95∶5)洗脫得到化合物3 22mg。
2結構鑒定米爾貝α23(1)分子式C41H55NO12；物態白色粉末；元素分析C 65.34％ H 7.30％ O 25.50％[α]20D-12°(c0.65，CHCl3)；V(MeOH)λmaxnm(logε)246(3.32)；R(KBr)，vmaxcm-13425(OH)，2926，1716，1649，592，1458，1415，1377，1261，1034，802，756，665；1H NMR(CDCl3，400MHz)and13C-NMR(CDCl3，100MHz)數據參看表1；ESIMS m/z 771[M+NH4]+；HRESIMS m/z 771.2303[(M+NH4)+，calcd for C41H59N2O12，771.2273]。
米爾貝α24(2)分子式C43H59NO12；物態白色粉末；元素分析C66.07％ H 7.55％ O 24.58％[α]20D-12°(c0.65，CHCl3)；UV(MeOH)λmaxnm(logε)246(3.32)；IR(KBr)，vmaxcm-13425(OH)，2926，1716，1649，1592，1458，1415，1377，1261，1034，802，756，665；1H NMR(CDCl3，400MHz)and13C-NMR(CDCl3，100MHz)數據參看表1；ESIMS m/z 799[M+NH4]+；HRESIMS m/z 799.2303[(M+NH4)+，calcd for C43H63N2O12，799.2273]。
米爾貝α25(3)分子式C37H54O10；物態白色粉末；元素分析C 71.84％ H 8.74％ O 19.42％[α]20D-12°(c 0.65，CHCl3)；UV(MeOH)λmaxnm(logε)246(3.32)；IR(KBr)，vmaxcm-13425(OH)，2926，1716，1649，1592，1458，1415，1377，1261，1034，802，756，665；1H NMR(CDCl3，400MHz)and13C-NMR(CDCl3，100MHz)數據參看表1；ESIMS m/z 657[M-H]+；HRESIMS m/z 657.2303[(M-H)+，calcd for C37H53O10，657.2273]。
表1米爾貝α23(1)，α24(2)，α25(3)1H-和13CNMR的數據(括號中為耦合常數)



3.抗蟲活性測定方法
(1)抗成蟲螨類的活性將供試化合物的0.1％甲醇溶液用含有0.01％去污劑的水稀釋10倍以制成100μg/ml的溶液。再配制成不同濃度的試驗用液，分別為100μg/ml，50μg/ml，30μg/ml，10μg/ml。
實驗將對有機磷類殺蟲劑敏感的二斑葉螨感染菜豆植株主葉片，一天以后，將感染二斑葉螨的葉片浸入到配置好的試驗溶液1-2s。在25℃讓植株生長三天，用顯微鏡觀察計算螨類死亡率。
(2)抗螨類蟲卵的活性將供驗化合物溶液分別配成100μg/ml，50μg/ml，30μg/ml，10μg/ml，用雌性二斑葉螨感染菜豆主葉片。觀察葉片上大概有40顆卵后再將成蟲移開。將感染二斑葉螨的葉片浸入到配置好的試驗溶液1-2s。在25℃讓植株生長十天，計算未長成成蟲的比率，即其死亡率。
(3)抗線蟲活性將供試化合物的0.1％甲醇溶液用含有0.01％去污劑的水稀釋10倍以制成100μg/ml的溶液。再配制成不同濃度的試驗用液，分別為100μg/ml，50μg/ml，30μg/ml，10μg/ml。
將配好的溶液加入1ml含有活線蟲的水懸液中，混合后25℃，放置15小時，線蟲不再活動，用立體顯微鏡觀察。線蟲不活動的比率，即其死亡率。
4.活性測定結果三種新的化合物米爾貝α23，α24和α25，具有強大的殺滅螨蟲和線蟲的活性，見表2、3。實驗證明，這些新化合物比以往所知的米爾貝菌素活性更強。一般來說，α型米爾貝霉素比β型活性強。但是，更高活性的半成品仍在不斷的研究中。
表2.米爾貝新化合物殺滅二斑葉螨成蟲和蟲卵的活性

表3.米爾貝新化合物殺滅線蟲的活性

*米爾貝A3 and A4混合(30∶70)
權利要求
1.一種用冰城鏈霉菌制備的新化合物，其特征是結構式為 其中R1可以是CH3或者是CH2CH3；R2可以是 或者是 R3可以是 或者是H。
2.根據權利要求1所述的用冰城鏈霉菌制備的新化合物，其特征是化合物1的R1是CH3，R2是 R3是
3.根據權利要求1所述的用冰城鏈霉菌制備的新化合物，其特征是化合物2的R1是CH3，R2是 R3是
4.根據權利要求1所述的用冰城鏈霉菌制備的新化合物，其特征是化合物3的R1是CH2CH3，R2是 R3是H。
5.一種用冰城鏈霉菌制備的新化合物的制備方法，其特征是(1)發酵菌株發酵菌種為冰城鏈霉菌；(2)斜面培養將0.4％的蔗糖，0.2％的酵母粉，0.5％的麥芽提取物，0.1％和脫脂奶粉，溶于水中，用1mol NaOH調pH至7.0，加2.0％的瓊脂，再調pH至7.2后121℃滅菌30min，28℃培養7-8天，用1ml無菌水將斜面的冰城鏈霉菌孢子洗下并制成孢子懸浮液；(3)種子培養培養基組成為蔗糖1％、蛋白凍0.4％、K2HPO40.05％，用250ml的三角瓶每瓶分裝25ml，將1ml孢子懸浮液加入25ml種子培養基中，置于搖床上28℃，250rpm培養42h；然后將重量比組成為蔗糖8％、大豆餅粉1％、酵母粉0.2％、牛肉膏0.1％、CaCO30.3％、K2HPO403％，MgSO4·7H2O 0.1％和FeSO4·7H2O 0.005％的培養基，調節pH至7.2，每100ml分裝于1L三角瓶，121℃滅菌30min，接種8ml含孢子懸浮液的種子培養基，至于搖床28℃，250rpm培養8天；(4)發酵液處理50L發酵液經200目篩網過濾，并且用水清洗發酵液，發酵液和清洗用的水全都棄掉，用30升甲醇浸提過濾后得到的濾渣，通過減壓蒸餾的方法最后將甲醇溶液濃縮到2升，再將濃縮液用相同體積的EtOAc浸提3次，將得到的EtOAc相，減壓蒸餾會產生25g油狀物質；將所得油狀物上硅膠柱進行層析，分別用石油醚∶丙酮的95∶5-50∶50的混合物洗脫，蒸餾得到不含A3和A4的粗制品10g；將粗制品分別用石油醚∶丙酮的9∶1-3∶1的混合物洗脫液進行洗脫，得到了五個組分，將組分四上RP-C18硅膠柱進行層析，用甲醇∶水＝70∶30-85∶15洗脫液進行洗脫，會得到化合物1、20mg和化合物2、11mg；將組分三上RP-C18硅膠柱進行層析，用甲醇∶水的70∶30-95∶5的混合物洗脫得到化合物3、22mg。
全文摘要
本發明提供的是一種用冰城鏈霉菌制備的新化合物－α型米爾貝霉素及其制備方法。它是從冰城鏈霉菌中分離的三種新化合物，其制備方法包括種子培養和液體發酵，發酵液經過濾后，用甲醇提取，EtOAc萃取，濃縮后硅膠柱層析，RP－18柱層析可得化合物。本發明的新化合物具有強的殺螨活性，同樣可用以控制其他會危害植物的昆蟲。
文檔編號A01N43/90GK101037442SQ20071007165
公開日2007年9月19日 申請日期2007年1月17日 優先權日2007年1月17日
發明者向文勝, 王相晶, 姜玲 申請人:東北農業大學