本發明涉及一種兼具水相儲存穩定性與高轉染性的脂質體/聚合物/核酸復合遞送體系，屬于生物材料。
背景技術：
1、mrna疫苗因其較短的開發周期和快速表達而能夠快速迭代，從而應對不斷變異的病毒毒株，而獲得廣泛的關注。與dna疫苗相比，mrna疫苗更高效，只需要在細胞質中一步翻譯成抗原，且mrna疫苗無需進入細胞核，沒有插入誘變的風險。同時，mrna療法為基于非分裂細胞的瞬時轉染，在細胞質中發揮作用，因此清除速度快，產生副作用的可能性低，具有重要的臨床研究價值和現實意義。然而，裸露的mrna在生理環境下穩定性極低，且高的負電荷密度極大限制了mrna的細胞攝取，因此需要開發安全、有效的mrna遞送體系，保護mrna免受降解，并攜帶mrna被細胞高效攝取，以實現有效的mrna治療。
2、脂質基核酸載體包括脂質體囊泡和依賴納米技術的脂質納米顆粒，能夠將mrna包裹在其內部親水空腔中，從而在復雜的生理環境下保護mrna免受核酸酶的降解，同時，脂質基核酸載體的磷脂雙分子層與細胞膜高度親和，能夠攜帶mrna高效地被細胞攝取。因此，脂質基核酸載體在mrna疫苗的研究中被廣泛應用。然而，脂質基核酸載體往往不能夠將mrna包裹成緊密的固體結構，從而在水環境中儲存時導致mrna被降解，因此面臨儲存穩定性差、儲存環境苛刻等問題。在當前臨床應用的核酸疫苗中，能夠保證脂質基核酸遞送系統有效性的手段通常是凍干及超低溫儲存，然而脂質基核酸遞送系統在凍干的過程中也具有脂質破碎、mrna泄露的風險，同時這種苛刻的儲存條件還產生著巨大的運輸成本。而在4℃冷藏條件下水相脂質基核酸遞送系統往往僅能穩定數天至數周。陽離子聚合物能夠依靠電荷相互作用壓縮mrna，形成較為緊密的納米結構。因此，將聚合物與脂質結合構成復合遞送系統是提升脂質基核酸遞送系統的水相儲存穩定性的有效策略。然而，當聚合物與mrna結合過于緊密時，會損失mrna在細胞中的釋放率，從而降低mrna的利用率，進一步導致其轉染效率的下降。因此，開發兼具水相儲存穩定性與高轉染性的脂質/聚合物復合遞送系統至關重要。
技術實現思路
1、本發明的目的在于提供一種兼具水相儲存穩定性與高轉染性的脂質體/聚合物/核酸復合遞送體系。采用本發明制備的脂質/聚合物/核酸復合遞送體系能夠在4℃的蔗糖溶液中保持長達三個月的轉染活性，同時在hek293t、hela、dc2.4、cho-k1、mscs細胞中實現良好的轉染效果。
2、本發明所提供的技術方案如下：
3、一種兼具水相儲存穩定性與高轉染性的脂質體/聚合物/核酸復合遞送體系，所述的遞送體系為脂質體包裹的聚合物/核酸復合物，其制備方法具體包括如下步驟：
4、步驟1：制備陽離子脂質體；
5、步驟2：將聚合物稀釋液與核酸稀釋液均勻混合，并靜置孵育至少30?min，制備得到聚合物/核酸復合物；
6、步驟3：將步驟1制備的陽離子脂質體與步驟2制備的聚合物/核酸復合物均勻混合，并靜置孵育至少40?min，得到脂質體包裹的聚合物/核酸復合物。
7、上述技術方案中，進一步的，所述的步驟1中的陽離子脂質體，具體的制備方法為，按摩爾比將(36-40)：(10-11)：(48-50)：(1-3)份陽離子脂質、磷脂、膽固醇和peg脂質在無水乙醇中充分溶解（更優選為40：10：48：2份），之后注入3-6倍體積的50-58℃?depc水（經焦碳酸二乙酯處理的水）中，攪拌獲得脂質液滴分散液，之后將分散液減壓旋轉蒸發以除去乙醇，最后經超聲波細胞粉碎機處理獲得陽離子脂質體分散液。
8、進一步的，所述步驟2的聚合物為分子量為2000-3000?g/mol的超支化聚賴氨酸，所述的稀釋液溶劑為depc水。
9、進一步的，所述脂質體、超支化聚賴氨酸與核酸的質量比為(5.8-7.5)：(0.3-1.5)：1，更優選為6.54：1：1。
10、進一步的，所述脂質體包裹的聚合物/核酸復合物的粒徑為100-300?nm，復合物的zeta電位為3-5?mv。
11、進一步的，所述的陽離子脂質為三氟乙酸二甲基-2,?3?-二油烯氧基丙基-2-（2-精胺甲酰氨基）乙基銨（dospa）、氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基銨（dotma）、1,2-二油酰-3-三甲基丙基氯化銨（dotap）、十七烷-9-基?8-（（2-羥基乙基）（6-氧代-6-（十一烷氧基）己基）氨基）辛酸酯（sm-102）、4-（n,n-二甲基氨基）丁酸（二亞油基）甲酯（dlin-mc3-dma）中的一種或幾種，所述的磷脂為二棕櫚酸磷脂酰膽堿（dppc）、二硬脂?；字Ｄ憠A（dspc）、二油酰磷脂酰乙醇胺（dope）中的一種或幾種，所述的peg脂質為甲氧基聚乙二醇雙十四烷基乙酰胺?（alc-0159）、二肉豆蔻酰甘油-聚乙二醇2000（dmg-peg?2000）中的一種或幾種。
12、進一步的，所述的核酸為dna、mrna中的至少一種。
13、所述遞送系統以水相在4℃下儲存長達三個月后，與細胞共培養能保持對細胞的轉染效率變化≤15%。所述細胞為hek293t、hela、dc2.4、cho-k1、mscs中的一種。
14、本發明的有益效果在于：
15、（1）本發明制備所得的脂質體包裹的聚合物/核酸復合物具有脂質層和聚合物/核酸復合物粒子核，能夠增強mrna抵抗水解的能力，在4℃水相的條件下維持長達三個月的轉染活性。
16、（2）本發明所制得的脂質體/聚合物/核酸復合物具有良好的mrna利用率，在儲存過程中仍保持高效的mrna釋放效果，能在增強復合物的穩定性的同時對多種細胞實現高的轉染效率。
17、（3）本發明制備方法簡單，可重復性高，在核酸疫苗領域具有很好的應用前景。
1.一種兼具水相儲存穩定性和高轉染性的脂質體/聚合物/核酸復合遞送體系，其特征在于，所述的遞送體系為脂質體包裹的聚合物/核酸復合物，其制備方法具體包括如下步驟：
2.根據權利要求1所述的兼具水相儲存穩定性和高轉染性的脂質體/聚合物/核酸復合遞送體系，其特征在于，步驟1中所述的陽離子脂質體的制備方法為：按摩爾比將(36-40)：(10-11)：(48-50)：(1-3)份陽離子脂質、磷脂、膽固醇和peg脂質在無水乙醇中充分溶解，之后注入3-6倍體積的50-58℃?depc水中，攪拌獲得脂質液滴分散液，之后將分散液減壓旋轉蒸發以除去乙醇，最后經超聲波細胞粉碎機處理獲得陽離子脂質體分散液。
3.根據權利要求1所述的兼具水相儲存穩定性和高轉染性的脂質體/聚合物/核酸復合遞送體系，其特征在于，步驟2中所述的聚合物為分子量為2000-3000?g/mol的超支化聚賴氨酸，所述的稀釋液的溶劑為depc水。
4.根據權利要求3所述的兼具水相儲存穩定性和高轉染性的脂質體/聚合物/核酸復合遞送體系，其特征在于，所述脂質體/聚合物/核酸復合遞送體系中脂質體、超支化聚賴氨酸與核酸的質量比為(5.8-7.5)：(0.3-1.5)：1。
5.根據權利要求1所述的兼具水相儲存穩定性和高轉染性的脂質體/聚合物/核酸復合遞送體系，其特征在于，所述脂質體包裹的聚合物/核酸復合物的粒徑為100-300?nm，復合物的zeta電位為3-5?mv。
6.根據權利要求1所述的兼具水相儲存穩定性和高轉染性的脂質體/聚合物/核酸復合遞送體系，其特征在于，所述水相儲存穩定為脂質體/聚合物/核酸復合遞送體系能在4℃的質量濃度10-15%蔗糖溶液中穩定儲存長達三個月。
7.根據權利要求2所述的兼具水相儲存穩定性和高轉染性的脂質體/聚合物/核酸復合遞送體系，其特征在于，所述的陽離子脂質為三氟乙酸二甲基-2,?3?-二油烯氧基丙基-2-（2-精胺甲酰氨基）乙基銨、氯化三甲基-2,3-二油烯氧基丙基銨、1,2-二油酰-3-三甲基丙基氯化銨、十七烷-9-基?8-（（2-羥基乙基）（6-氧代-6-（十一烷氧基）己基）氨基）辛酸酯、4-（n,n-二甲基氨基）丁酸（二亞油基）甲酯中的一種或幾種，所述的磷脂為二棕櫚酸磷脂酰膽堿、二硬脂?；字Ｄ憠A、二油酰磷脂酰乙醇胺中的一種或幾種，所述的peg脂質為甲氧基聚乙二醇雙十四烷基乙酰胺、二肉豆蔻酰甘油-聚乙二醇2000中的一種或幾種。
8.根據權利要求1所述的兼具水相儲存穩定性和高轉染性的脂質體/聚合物/核酸復合遞送體系，其特征在于，所述的核酸為dna、mrna中的至少一種。
9.根據權利要求6所述的兼具水相儲存穩定性和高轉染性的脂質體/聚合物/核酸復合遞送體系，其特征在于，所述遞送體系以水相在4℃下儲存長達三個月后，與細胞共培養能保持對細胞的轉染效率變化≤15%。
10.根據權利要求9所述的兼具水相儲存穩定性和高轉染性的脂質體/聚合物/核酸復合遞送體系，其特征在于，脂質體/聚合物/核酸復合遞送體系在hek293t、hela、dc2.4、cho-k1、mscs細胞上進行轉染。