本發(fā)明涉及生物，具體涉及一種h5n1流感通用mrna疫苗的制備及應(yīng)用。
背景技術(shù)：
1、h5n1高致病性禽流感病毒因其高致死率（約50%-60%）、跨物種傳播風(fēng)險(xiǎn)及快速進(jìn)化特性，已成為全球公共衛(wèi)生安全的重大威脅。自1997年首次感染人類(lèi)以來(lái)，h5n1已累計(jì)導(dǎo)致近千例人類(lèi)感染，病死率遠(yuǎn)超季節(jié)性流感。2024年監(jiān)測(cè)數(shù)據(jù)顯示，新型d1.1基因分型毒株在哺乳動(dòng)物（如奶牛、豬）中廣泛傳播，其ha蛋白的哺乳動(dòng)物適應(yīng)性突變顯著增強(qiáng)了病毒對(duì)人類(lèi)呼吸道的感染能力。更嚴(yán)峻的是，h5n1病毒在禽類(lèi)與哺乳動(dòng)物間的跨宿主傳播加速了基因重組風(fēng)險(xiǎn)，可能催生兼具高致死率與人際傳播能力的新毒株。而現(xiàn)有防控體系存在顯著缺陷：1、廣譜性不足：傳統(tǒng)雞胚滅活疫苗依賴(lài)單一病毒株ha抗原，對(duì)快速變異的h5n1毒株（如2.3.4.4b）交叉保護(hù)效力低于30%，且無(wú)法覆蓋高頻突變區(qū)域，無(wú)法有效激活老年及免疫低下人群的免疫應(yīng)答；2、生產(chǎn)響應(yīng)滯后：傳統(tǒng)疫苗生產(chǎn)周期長(zhǎng)達(dá)6個(gè)月，難以應(yīng)對(duì)新發(fā)變異株的快速傳播；3、免疫應(yīng)答單一：現(xiàn)有mrna疫苗雖可快速編碼ha抗原，但僅針對(duì)單一流行株構(gòu)象表位，無(wú)法激活對(duì)異源毒株的交叉中和抗體及多克隆t細(xì)胞免疫。因此，亟需開(kāi)發(fā)廣譜、高效的h5n1流感疫苗。
2、基于mosaic抗原設(shè)計(jì)策略的新型疫苗技術(shù)為應(yīng)對(duì)流感病毒高度變異性提供了突破方向。該技術(shù)通過(guò)構(gòu)建同源蛋白庫(kù)進(jìn)行多輪重組比對(duì)，篩選出覆蓋天然蛋白9-12個(gè)氨基酸短肽最大變異譜的代表性重組抗原。此類(lèi)抗原通過(guò)排除非天然及稀有“k-mers”，最大化保留關(guān)鍵保守表位，可顯著提升疫苗對(duì)異源毒株的交叉中和能力。雖然mosaic策略已在hiv疫苗研發(fā)中驗(yàn)證其廣譜潛力，但其在流感領(lǐng)域的應(yīng)用受限于重組蛋白表達(dá)效率低、免疫原性不足等瓶頸。例如，哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)成本高昂、蛋白折疊效率有限，導(dǎo)致基于mosaic設(shè)計(jì)的流感重組蛋白疫苗難以規(guī)模化生產(chǎn)；同時(shí)，單一蛋白抗原難以同時(shí)激活高效價(jià)中和抗體與持久的t細(xì)胞免疫應(yīng)答。
3、與此同時(shí)，mrna疫苗技術(shù)因covid-19疫情中的成功應(yīng)用而迅速發(fā)展。與傳統(tǒng)疫苗相比，mrna技術(shù)具有三大核心優(yōu)勢(shì)：其一，可在數(shù)周內(nèi)完成抗原編碼序列的理性設(shè)計(jì)與優(yōu)化，快速響應(yīng)病毒變異；其二，通過(guò)脂質(zhì)納米顆粒（lnp）遞送的mrna能在宿主細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)天然構(gòu)象抗原，精準(zhǔn)呈現(xiàn)關(guān)鍵構(gòu)象表位；其三，可通過(guò)多價(jià)mrna共遞送靈活編碼多組保守表位，突破傳統(tǒng)疫苗的抗原容量限制。然而，現(xiàn)有流感mrna疫苗多聚焦于單一流行株血凝素（ha）抗原，雖能誘導(dǎo)株特異性免疫，但對(duì)h5n1等高變異病毒的廣譜保護(hù)能力仍顯不足。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本發(fā)明的目的是提供一種h5n1流感通用mrna疫苗及其應(yīng)用。
2、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明首先提供了一種h5n1流感通用mrna疫苗。
3、本發(fā)明提供的h5n1流感通用mrna疫苗含有mrna分子1和mrna分子2；
4、所述mrna分子1含有編碼h5m蛋白的mrna序列：
5、所述mrna分子2含有編碼n1m蛋白的mrna序列：
6、所述h5m蛋白為如下a1）-a4）中的任一種：
7、a1）氨基酸序列是seq?id?no:1所示的蛋白質(zhì)；
8、a2）在seq?id?no:1所示的氨基酸序列的n端和/或c端連接標(biāo)簽得到的具有相同功能的融合蛋白質(zhì)；
9、a3）將seq?id?no:1所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)；
10、a4）與seq?id?no:1所示的氨基酸序列具有80％或80%以上同一性且具有相同功能的蛋白質(zhì)；
11、所述n1m蛋白為如下b1）-b4）中的任一種：
12、b1）氨基酸序列是seq?id?no:2所示的蛋白質(zhì)；
13、b2）在seq?id?no:2所示的氨基酸序列的n端和/或c端連接標(biāo)簽得到的具有相同功能的融合蛋白質(zhì)；
14、b3）將seq?id?no:2所示的氨基酸序列經(jīng)過(guò)一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白質(zhì)；
15、b4）與seq?id?no:2所示的氨基酸序列具有80％或80%以上同一性且具有相同功能的蛋白質(zhì)。
16、上述a2）或b2）所述蛋白質(zhì)中，所述標(biāo)簽是指利用dna體外重組技術(shù)，與目的蛋白一起融合表達(dá)的一種多肽或者蛋白質(zhì)，以便于目的蛋白的表達(dá)、檢測(cè)、示蹤和/或純化。所述標(biāo)簽包括但不限于：gst（谷胱甘肽巰基轉(zhuǎn)移酶）標(biāo)簽蛋白、his6標(biāo)簽蛋白（his-tag）、mbp（麥芽糖結(jié)合蛋白）標(biāo)簽蛋白、flag標(biāo)簽蛋白、sumo標(biāo)簽蛋白、ha標(biāo)簽蛋白、myc標(biāo)簽蛋白、egfp（增強(qiáng)型綠色熒光蛋白）、ecfp（增強(qiáng)型青色熒光蛋白）、eyfp（增強(qiáng)型黃綠色熒光蛋白）、mcherry（單體紅色熒光蛋白）或avitag標(biāo)簽蛋白。
17、上述a3）或b3）所述蛋白質(zhì)中，所述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過(guò)10個(gè)或9個(gè)或8個(gè)或7個(gè)或6個(gè)或5個(gè)或4個(gè)或3個(gè)或2個(gè)或1個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。
18、上述a4）或b4）所述蛋白質(zhì)中，所述同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用國(guó)際互聯(lián)網(wǎng)上的同源性檢索站點(diǎn)測(cè)定氨基酸序列的同一性，如ncbi主頁(yè)網(wǎng)站的blast網(wǎng)頁(yè)。例如，可在高級(jí)blast2.1中，通過(guò)使用blastp作為程序，將expect值設(shè)置為10，將所有filter設(shè)置為off，使用blosum62作為matrix，將gap?existence?cost，per?residue?gap?cost和lambda?ratio分別設(shè)置為11，1和0.85（缺省值）并進(jìn)行檢索一對(duì)氨基酸序列的同一性進(jìn)行計(jì)算，然后即可獲得同一性的值（%）。所述同一性包括與本發(fā)明的seq?id?no:1或seq?idno:2所示的氨基酸序列具有80%或更高，或具有85%或更高，或具有90%或更高，或91%或更高，或92%或更高，或93%或更高，或94%或更高，或95%或更高，或96%或更高，或97%或更高，或98%或更高，或99%或更高同一性的氨基酸序列。
19、上述a1）或a2）或a3）或a4）或b1）或b2）或b3）或b4）所述蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。
20、進(jìn)一步的，所述h5m蛋白的編碼基因序列為下述任一種：
21、e1）seq?id?no:3第86-1789位所示的dna分子；
22、e2）與e1）限定的核苷酸序列具有75%或75%以上的同一性，并且編碼所述h5m蛋白的dna分子。
23、所述n1m蛋白的編碼基因序列為下述任一種：
24、f1）seq?id?no:4第86-1495位所示的dna分子；
25、f2）與f1）限定的核苷酸序列具有75%或75%以上的同一性，并且編碼所述n1m蛋白的dna分子。
26、本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以很容易地采用已知的方法，例如定向進(jìn)化和點(diǎn)突變的方法，對(duì)本發(fā)明的編碼h5m蛋白或n1m蛋白的核苷酸序列進(jìn)行突變。那些經(jīng)過(guò)人工修飾的，具有與本發(fā)明的h5m或n1m核苷酸序列75%或者更高同一性的核苷酸，只要編碼h5m蛋白或n1m蛋白且具有相同功能，均是衍生于本發(fā)明的核苷酸序列并且等同于本發(fā)明的序列。所述同一性是指與天然或人工核酸序列的序列相似性，包括與本發(fā)明的編碼seq?id?no:1或seq?idno:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的核苷酸序列具有75%或更高，或80%或更高，或85%或更高，或90%或更高，或95%或更高同一性的核苷酸序列。同一性可以用肉眼或計(jì)算機(jī)軟件進(jìn)行評(píng)價(jià)。使用計(jì)算機(jī)軟件，兩個(gè)或多個(gè)序列之間的同一性可以用百分比（%）表示，其可以用來(lái)評(píng)價(jià)相關(guān)序列之間的同一性。
27、再進(jìn)一步的，所述mrna分子1自5’端至3’端依次包括5’帽子結(jié)構(gòu)、5’utr序列、編碼h5m蛋白的mrna序列、kozak序列、3’utr序列以及polya序列；
28、所述mrna分子2自5’端至3’端依次包括5’帽子結(jié)構(gòu)、5’utr序列、編碼n1m蛋白的mrna序列、kozak序列、3’utr序列以及polya序列。
29、在一些實(shí)施方案中，所述5’端帽結(jié)構(gòu)為cap1結(jié)構(gòu)。
30、在一些實(shí)施方案中，所述5’utr序列如seq?id?no:7第1-50位所示。
31、在一些實(shí)施方案中，所述3’utr序列如seq?id?no:7第1776-1885位所示。
32、在一些實(shí)施方案中，所述polya序列如seq?id?no:7第1886-2007位所示。
33、在一些實(shí)施方案中，所述mrna分子1的全序列如seq?id?no:7所示。
34、在一些實(shí)施方案中，所述mrna分子2的全序列如seq?id?no:8所示。
35、更進(jìn)一步的，所述h5n1流感mrna疫苗含有脂質(zhì)體納米顆粒包裹的mrna分子1和脂質(zhì)體納米顆粒包裹的mrna分子2。
36、在一些實(shí)施方案中，所述脂質(zhì)體納米顆粒包含離子化脂質(zhì)、輔助脂質(zhì)、膽固醇和peg脂質(zhì)。
37、在一些實(shí)施方案中，所述h5n1流感mrna疫苗中的所述mrna分子1和所述mrna分子2的質(zhì)量比為1:1。
38、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明還提供了如下任一種物質(zhì)：
39、m1）蛋白，所述蛋白為上述h5m蛋白或上述n1m蛋白；
40、m2）編碼m1）所述蛋白的核酸分子；
41、m3）含有m2）所述核酸分子的表達(dá)盒；
42、m4）含有m2）所述核酸分子或m3）所述表達(dá)盒的重組載體；
43、m5）含有m2）所述核酸分子或m3）所述表達(dá)盒或m4）所述重組載體的重組微生物；
44、m6）成套mrna分子，所述成套mrna分子包括上述mrna分子1和上述mrna分子2；
45、m7）負(fù)載有m6）所述成套mrna分子的脂質(zhì)體納米顆粒；
46、m8）mrna分子，所述mrna分子為上述mrna分子1或上述mrna分子2；
47、m9）負(fù)載有m8）所述mrna分子的脂質(zhì)體納米顆粒；
48、m10）h5n1流感病毒感染預(yù)防治療制劑，所述h5n1流感病毒感染預(yù)防治療制劑的有效活性成分含有m6）所述的成套mrna分子或m7）所述的脂質(zhì)體納米顆粒或m8）所述的mrna分子或m9）所述的脂質(zhì)體納米顆粒。
49、上述m2）中，所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因組dna或重組dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna或hnrna等。
50、在一些實(shí)施方案中，所述核酸分子為seq?id?no:3第86-1789位或與seq?id?no:3第86-1789位具有75%或75%以上同一性且編碼所述h5m蛋白的dna分子。
51、在一些實(shí)施方案中，所述核酸分子為seq?id?no:4第86-1495位或與seq?id?no:4第86-1495位具有75%或75%以上同一性且編碼所述n1m蛋白的dna分子。
52、上述m3）中，所述表達(dá)盒是指能夠在宿主細(xì)胞中表達(dá)上述h5m蛋白或n1m蛋白的dna，該dna不但可包括啟動(dòng)上述h5m蛋白或n1m蛋白轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子，還可包括終止上述h5m蛋白或n1m蛋白轉(zhuǎn)錄的終止子。在一些實(shí)施方案中，所述表達(dá)盒還可包括增強(qiáng)子序列。
53、上述m4）中，所述載體可為質(zhì)粒、黏粒、噬菌體或病毒載體。所述重組載體可為利用現(xiàn)有的表達(dá)載體構(gòu)建的含有上述核酸分子或上述表達(dá)盒的載體。在一些實(shí)施方案中，所述重組載體為將seq?id?no:3或seq?id?no:4所示的dna分子連入至puc57-kan載體后得到的載體。
54、上述m5）中，所述細(xì)胞可為原核生物細(xì)胞或真核生物細(xì)胞。
55、上述m7）中，所述遞送系統(tǒng)可為本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的任一種可用于mrna分子遞送的系統(tǒng)，包括但不限于脂質(zhì)納米顆粒遞送系統(tǒng)、病毒樣顆粒遞送系統(tǒng)、聚合物基遞送系統(tǒng)、肽基遞送系統(tǒng)等。在一些實(shí)施方案中，所述遞送系統(tǒng)為脂質(zhì)納米顆粒遞送系統(tǒng)。
56、制備所述h5n1流感通用mrna疫苗時(shí)，還可加入稀釋劑、助溶劑、緩沖劑、ph調(diào)節(jié)劑等輔料，如生理鹽水。
57、所述h5n1流感通用mrna疫苗可以經(jīng)注射給藥，包括皮下注射、靜脈注射、肌肉注射和腔內(nèi)注射等，或經(jīng)呼吸道給藥，包括鼻噴、口腔吸入給藥等。
58、利用所述h5n1流感通用mrna疫苗在預(yù)防和/或治療h5n1流感病毒感染時(shí)，給予受試者生物體有效量的上述h5n1流感通用mrna疫苗。
59、為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供了如下任一種應(yīng)用：
60、n1）上述m1）-m9）任一所述的物質(zhì)在制備上述h5n1流感通用mrna疫苗中的應(yīng)用；
61、n2）上述h5n1流感通用mrna疫苗或上述物質(zhì)在制備用于治療和/或預(yù)防h5n1流感病毒感染的產(chǎn)品中的應(yīng)用；
62、n3）上述h5n1流感通用mrna疫苗或上述物質(zhì)在制備用于中和h5n1流感病毒的產(chǎn)品中的應(yīng)用；
63、n4）上述h5n1流感通用mrna疫苗或上述物質(zhì)在制備h5n1流感病毒抗體中的應(yīng)用。
64、上述任一所述h5n1流感病毒可為如下毒株中的至少一種：a/environment/hubei/950/2013、a/jiangsu/nj210/2023、a/american?wigeon/south?carolina/22-000345、a/hubei/29578/2016、a/fujian-sanyuan/21099/2017、a/guangdong/18sf020/2018、a/hunan/09911/2021、a/sichuan/06681/2021、a/astrakhan/3212/2020、a/anhui/01/2005。
65、上述任一所述產(chǎn)品可為疫苗或藥物。
66、本發(fā)明提供了一種基于mosaic抗原設(shè)計(jì)策略的h5n1流感通用mrna疫苗及其制備方法，通過(guò)以下創(chuàng)新突破現(xiàn)有技術(shù)瓶頸：1、mosaic-ha抗原設(shè)計(jì)：利用計(jì)算機(jī)輔助算法篩選h5n1病毒ha、na蛋白的高度保守表位（如融合肽區(qū)、莖部區(qū)）及高頻變異區(qū)域（如抗原決定簇），通過(guò)多輪重組比對(duì)構(gòu)建嵌合ha抗原序列，覆蓋90%以上流行毒株的“k-mer”短肽譜，最大化交叉保護(hù)潛力；2、mrna高效遞送：將優(yōu)化后的mosaic?ha抗原編碼序列通過(guò)脂質(zhì)納米顆粒（lnp）封裝為mrna疫苗，利用宿主細(xì)胞直接表達(dá)天然構(gòu)象抗原，保留關(guān)鍵構(gòu)象表位，同時(shí)避免傳統(tǒng)蛋白疫苗的折疊缺陷；3、多維度免疫激活：通過(guò)mosaicha抗原的多表位呈現(xiàn)，同步激活針對(duì)保守區(qū)（廣譜中和抗體）與變異區(qū)（株特異性抗體）的b細(xì)胞應(yīng)答，并誘導(dǎo)針對(duì)ha蛋白多個(gè)結(jié)構(gòu)域的cd4+/cd8+t細(xì)胞免疫，提升免疫持久性；4、快速迭代能力：基于mrna平臺(tái)的模塊化設(shè)計(jì)，可在4-6周內(nèi)完成新變異株抗原序列的整合與疫苗更新，顯著優(yōu)于傳統(tǒng)疫苗的6個(gè)月生產(chǎn)周期。
67、本發(fā)明通過(guò)計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)篩選h5n1病毒高度保守表位及高頻變異區(qū)域，設(shè)計(jì)基于mosaic策略的廣譜抗原；并利用mrna平臺(tái)快速編碼并遞送該抗原，制備的h5n1流感通用mrna疫苗可實(shí)現(xiàn)在宿主細(xì)胞內(nèi)高效表達(dá)天然構(gòu)象蛋白，不僅能覆蓋h5n1病毒的主要變異譜，還可通過(guò)激活交叉中和抗體與多克隆t細(xì)胞免疫，突破傳統(tǒng)疫苗的廣譜性限制，為應(yīng)對(duì)h5n1的持續(xù)進(jìn)化及潛在大流行提供關(guān)鍵技術(shù)支撐。
68、本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明通過(guò)整合mosaic抗原設(shè)計(jì)策略與mrna技術(shù)開(kāi)發(fā)的h5n1流感通用疫苗展現(xiàn)出顯著優(yōu)勢(shì)。具體體現(xiàn)為：首先，在廣譜性方面，嵌合ha抗原廣泛覆蓋h5n1流感病毒ha、na蛋白的t淋巴細(xì)胞表位，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)顯示其對(duì)2.3.4.4b、2.3.4.4d、2.3.4.4h分支的候選疫苗株均有交叉保護(hù)效力；其次，在生產(chǎn)效能方面，mrna技術(shù)使疫苗研發(fā)周期縮短至4-6周，且無(wú)需依賴(lài)雞胚培養(yǎng)或復(fù)雜蛋白純化工藝，可快速響應(yīng)新發(fā)變異株。此外，lnp遞送系統(tǒng)保障了抗原的天然構(gòu)象表達(dá)，避免了傳統(tǒng)重組蛋白的折疊缺陷。綜上所述，本發(fā)明制備的h5n1流感通用mrna疫苗兼具廣譜保護(hù)、快速迭代與低成本量產(chǎn)特性，為防控h5n1病毒跨物種傳播及潛在大流行提供了突破性解決方案。