一種α?酮戊二酸的制備方法與流程

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種α-酮戊二酸的制備方法。

背景技術(shù)：

α-酮戊二酸(2-Ketoglutaric acid)，又稱2-氧代戊二酸，是一種重要的生物分子，是三羧酸循環(huán)中重要的中間產(chǎn)物之一，是氮的輸送體和分子氧化中的共生物質(zhì)。在微生物細胞的代謝中起著重要的作用，也是合成多種氨基酸，蛋白質(zhì)的重要前體物質(zhì)。在可用于營養(yǎng)強化劑，作為運動營養(yǎng)飲料的成分，有機中間體，生化試劑和測肝功能的配套試劑，體格增強補劑等方面。此外，α-酮戊二酸可制備1：1和2：1的L-精氨酸α-酮戊二酸，用于運動營養(yǎng)劑。

現(xiàn)有α-酮戊二酸的生產(chǎn)工藝基本是以化學(xué)合成法和生物發(fā)酵法為主。

化學(xué)合成法主要是以丁二酸二乙酯、草酸二乙酯等為原料，經(jīng)縮合、水解合成α-酮戊二酸。例如張國基(中國發(fā)明專利申請公開號CN102584568A)以二氯乙酸甲酯和丙烯酸甲酯為原料，在甲醇鈉存在的條件下，合成中間體2,2-二氯戊二酸二甲酯，再與堿溶液反應(yīng)得到α-酮戊二酸水溶液粗品，精制后得到α-酮戊二酸產(chǎn)品?；瘜W(xué)合成法生產(chǎn)α-酮戊二酸，雖然具有收率高、原料易得的特點，但反應(yīng)過程中大量有機溶劑的使用，以及多步復(fù)雜的合成反應(yīng)過程中會產(chǎn)生大量副產(chǎn)物從而增加分離成本，使得化學(xué)合成法總成本偏高、對環(huán)境不友好，不適合于工業(yè)化生產(chǎn)，不能滿足市場的需求。

相對于化學(xué)合成法，生物發(fā)酵法制備α-酮戊二酸，具有生產(chǎn)條件溫和、工藝步驟簡單、對環(huán)境友好等特點。但是，生物發(fā)酵也有其缺點：生產(chǎn)周期長，產(chǎn)量低，產(chǎn)品與發(fā)酵液中多種成分混合在一起，導(dǎo)致提取與精制工藝復(fù)雜，總成本還是偏高。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種α-酮戊二酸的制備方法。

本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

一種α-酮戊二酸的制備方法，它以L-谷氨酸或其鹽作為原料，通過L-谷氨酸脫氨酶在pH＝8.0-9.0、溫度30-50℃的條件下脫去L-谷氨酸上的氨基，再經(jīng)活性炭脫色、過濾、經(jīng)陽離子交換樹脂柱純化、濃縮、結(jié)晶得到α-酮戊二酸成品。

本發(fā)明所述的α-酮戊二酸的制備方法，包括以下具體步驟：

步驟(1)、L-谷氨酸或其鹽溶于pH＝8.0-9.0的堿性去離子水中得到料液；往料液中加入L-谷氨酸脫氨酶，在溫度30～50℃下，L-谷氨酸或其鹽脫去氨基，得到轉(zhuǎn)化液；

步驟(2)、轉(zhuǎn)化液加熱至80～85℃，保溫0.5～2小時使L-谷氨酸脫氨酶失活；再降溫至60～70℃，用硫酸調(diào)節(jié)pH＝2.5～3.0，加入活性炭脫色，過濾得到濾液；

步驟(3)、濾液上732陽離子交換樹脂柱進行分離純化得純化液；

步驟(4)、純化液真空濃縮至析出結(jié)晶，濃縮液在溫度3～4℃下結(jié)晶，抽濾、固體在溫度60～65℃下真空烘箱烘干得α-酮戊二酸產(chǎn)品。

步驟(1)中，采用NaOH水溶液調(diào)節(jié)去離子水的pH得到堿性去離子水。

優(yōu)選的，所述的堿性去離子水的pH＝8.8。

所述的L-谷氨酸或其鹽與去離子水的摩爾比為0.5～1：25～30，優(yōu)選為0.8～1：26～28。

優(yōu)選的，所述的溫度為37～39℃。

所述的L-谷氨酸脫氨酶和去離子水的質(zhì)量體積比(g：mL)為0.02～0.08：100，優(yōu)選為0.02～0.03：100。L-谷氨酸或其鹽在L-谷氨酸脫氨酶作用下轉(zhuǎn)化直至L-谷氨酸的殘留小于0.1％。

所述的L-谷氨酸脫氨酶的濃度不低于200U/g，優(yōu)選為200U/g。L-谷氨酸脫氨酶可以是純化形式的、未純化形式的、固定化的或未固定化的L-谷氨酸脫氨酶。

本發(fā)明所述的L-谷氨酸脫氨酶可以通過以下方法制得：用滅菌接種環(huán)挑取一環(huán)大腸桿菌AS1.505，接種到250mL液體培養(yǎng)基中，在溫度28～30℃、轉(zhuǎn)速120轉(zhuǎn)/分條件下振動培養(yǎng)，培養(yǎng)18個小時左右，3000轉(zhuǎn)/分超速離心，沉淀物依次水洗、丙酮洗、乙醚洗，干燥獲得L-谷氨酸脫氨酶。其中，液體培養(yǎng)基組分含量(g/mL)：L-谷氨酸：0.5％，玉米漿：0.4％，酵母浸膏：1％，硫酸鎂：0.2％，磷酸二氫鉀：0.1％，氨調(diào)節(jié)pH7.5～7.7。大腸桿菌AS1.505可以購買得到。

步驟(2)中，所述的活性炭加入質(zhì)量為轉(zhuǎn)化液體積的1％，即活性炭的質(zhì)量與轉(zhuǎn)化液的體積之比為1g：100mL。

步驟(3)中，濾液上732陽離子交換樹脂柱進行分離純化的具體方法：濾液上732陽離子交換樹脂柱，收集柱下流出液，濾液上完后采用無離子水壓柱，收集壓柱液，柱下流出液和壓柱液采用茚三酮檢測，無氨基酸黃色反應(yīng)，說明L-谷氨酸被陽樹脂吸附，合并無氨基酸黃色反應(yīng)的柱下流出液和壓柱液，得純化液。

本發(fā)明的有益效果：

本發(fā)明方法具有反應(yīng)條件溫和、生產(chǎn)周期短、產(chǎn)品濃度和收率高、環(huán)保壓力小、適合大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)等優(yōu)點。

本發(fā)明制備α-酮戊二酸的方法，相比于谷氨酸氧化酶具有不需要使用過氧化氫，反應(yīng)條件更溫和、更安全。采用陽離子樹脂分離未轉(zhuǎn)化殘留的L-谷氨酸與α-酮戊二酸產(chǎn)品，確保產(chǎn)品的收率，回收的L-谷氨酸可以繼續(xù)當(dāng)作起始原料。

具體實施方式

下面通過具體實施方式對本發(fā)明的技術(shù)方案作進一步說明。

實施例1

一種α-酮戊二酸的制備方法，以L-谷氨酸為原料，具體包括以下步驟：

步驟(1)、稱取L-谷氨酸120g，去離子水500mL，用濃度為32％的工業(yè)液堿(即NaOH)調(diào)節(jié)溶液體系的pH至8.8使L-谷氨酸完全溶解，加熱至37～39℃；

稱取L-谷氨酸脫氨酶15g(濃度200U/g，同下)，攪拌加入上述配料液中，采用熱水浴控制反應(yīng)溫度在37～39℃，定時取樣，采用華勃氏呼吸儀檢測L-谷氨酸含量，約58～60小時，可測得L-谷氨酸的殘留小于0.1％，得到轉(zhuǎn)化液；

采樣時間：前24小時每隔8小時取樣檢測L-谷氨酸殘留含量，24小時后每4小時檢測L-谷氨酸殘留含量，48小時后每2小時取樣檢測L-谷氨酸殘留含量；

步驟(2)、將轉(zhuǎn)化液加熱至83～85℃，維持該溫度1小時使L-谷氨酸酶脫氨酶失活，再冷卻至68℃，用98％硫酸調(diào)節(jié)pH＝2.5～3.0確保L-谷氨酸全部轉(zhuǎn)為陽離子，加入1％活性炭，攪拌脫色2小時，過濾得濾液；

步驟(3)、濾液上732陽離子交換樹脂柱，收集柱下流出液，濾液上完后采用無離子水壓柱，收集壓柱液，確保柱下流出液和壓柱液茚三酮檢測無氨基酸黃色反應(yīng)，說明L-谷氨酸被陽樹脂吸附，合并柱下流出液和壓柱液，得純化液；

步驟(4)、純化液真空濃縮至析出結(jié)晶，攪拌、自然降溫至室溫后放入冰箱在3～4℃結(jié)晶，抽濾、固體在溫度62℃下真空烘箱烘干得α-酮戊二酸產(chǎn)品90g，收率：75％。

實施例2

一種α-酮戊二酸的制備方法，以L-谷氨酸鈉一水物為原料，具體包括以下步驟：

步驟(1)、稱取L-谷氨酸鈉一水物152g，去離子水500mL，用濃度為30％的工業(yè)液堿調(diào)節(jié)料液pH至8.8，加熱至37～39℃；

稱取L-谷氨酸脫氨酶15g，攪拌加入上述配料液中，采用熱水浴控制體系溫度37-39℃，定時取樣(同實施例1)，采用華勃氏呼吸儀檢測L-谷氨酸含量，約58～60小時，可測得L-谷氨酸的殘留小于0.1％，得到轉(zhuǎn)化液；

步驟(2)、將轉(zhuǎn)化液加熱至83～85℃，維持1小時，冷卻至70℃，用98％硫酸調(diào)節(jié)pH＝2.5～3.0，加入活性炭1％，攪拌脫色2小時，過濾得濾液；

步驟(3)、濾液上732陽離子交換樹脂柱，收集柱下流出液，濾液上完后采用無離子水壓柱，收集壓柱液，確保柱下流出液和壓柱液茚三酮檢測無氨基酸黃色反應(yīng)，合并柱下流出液和壓柱液，得純化液；

步驟(4)、純化液真空濃縮至析出結(jié)晶，攪拌、自然降溫至室溫后放入冰箱在3～4℃結(jié)晶，抽濾、固體在溫度60℃下真空烘箱烘干得α-酮戊二酸產(chǎn)品116g，收率：76.3％。

實施例1和2制備得到的α-酮戊二酸產(chǎn)品的檢測結(jié)果