核酸測序裝置及系統的制作方法

本發明涉及一種核酸測序裝置，具體是涉及一種基于焦磷酸測序的核酸測序裝置，屬于基因檢測領域。

背景技術：

一、焦磷酸測序概況

焦磷酸測序技術(Pyrosequencing)是于1987年發展起來的、基于DNA合成過程中釋放的焦磷酸(PPi)檢測的測序技術，焦磷酸測序反應在一系列酶的催化作用下的，其過程中會產生與脫氧三磷酸核苷(dNTP)的聚合數目成比例的可見光，通過對可見光檢測可達到測定DNA序列的目的。焦磷酸測序有兩種實現方法：液相焦磷酸測序法(Liquid Phase Pyrosequencing)和固相焦磷酸測序法(Solid Phase Pyrosequencing)。

液相焦磷酸測序是由4種酶催化的同一反應體系中的酶級聯化學發光反應，其原理是：引物與模板DNA退火后，在DNA聚合酶(DNA polymerase)、ATP硫酸化酶(ATP sμLfurylase)、熒光素酶(1uciferase)和三磷酸腺苷雙磷酸酶(Apyrase)協同作用下，將引物DNA上每一個dNTP的聚合與熒光信號的釋放偶聯起來，通過檢測熒光的釋放和強度，達到實時測定DNA序列的目的(馬永平等，焦磷酸測序技術及其在分子生物學領域的應用[J].國外醫學分子生物學分冊2003，25(2)：115-117)。

液相焦磷酸測序的反應體系由反應底物、待測單鏈、特異性測序引物和酶構成，反應底物為5’-磷酰硫酸(APS)和熒光素(1uciferin)。液相焦磷酸測序反應過程是一個向反應體系中輪流加入4種dNTP參與反應的過程，每輪反應只有一種dNTP參加。如果加入的dNTP剛好能和DNA模板的下一個堿基配對，則其在DNA聚合酶的作用下被添加到測序引物的3’末端，同時釋放出一個分子的焦磷酸(PPi)；在ATP硫酸化酶的作用下，生成的PPi和APS結合形成ATP；在熒光素酶的作用下，生成的ATP又和熒光素結合形成氧化熒光素，同時產生可見光。如果加入的這種dNTP剛好能和DNA模板的下面連續n個相同堿基匹配，根據反應方程式可知，釋放出的可見光強度應是只有1個堿基匹配時的n倍，也即反應過程中釋放的光強度與相匹配的堿基數目成比例關系。如果加入的dNTP和DNA模板的下一個堿基不匹配，則上述反應不會發生，也沒有可見光的釋放。未參加反應的dNTP和ATP在核苷酸降解酶Apyrase的作用下降解。

每輪反應釋放出的可見光通過微弱光檢測裝置轉化，再被處理為數字信號，經PC軟件處理即可獲得一個特異的檢測峰，峰值的高低應和相匹配的堿基數目成比例關系。

待上一輪反應結束后，加入另一種dNTP，重復進行上述反應。最終可根據獲得的光強度峰值圖即可讀取的待測DNA序列信息。

需要注意的是：dATP的降解產物脫氧單磷酸鳥苷(dAMP)是熒光素酶的抑制劑，隨著反應的進行，其濃度會越來越高，會阻礙焦磷酸測序化學發光反應的繼續進行。這也是焦磷酸測序法測序長度較短(通常為20bp～30bp)的主要原因(Shendure J，et a1.Advanced sequencing technologies:Methods and goals，Nat.Rev Genet.，2004，5(5)：335-44)。

固相焦磷酸測序是由3種酶催化的化學發光反應，與液相焦磷酸測序相比，沒有三磷酸腺苷雙磷酸酶參加。固相焦磷酸測序反應過程如下：結合了引物的DNA模板被固定于支撐物上并在反應過程中保持位置不變；加入一種dNTP后，在DNA聚合酶、ATP硫酸化酶和熒光素酶協同作用下發生反應，除了沒有降解反應發生，其他反應與液相焦磷酸測序完全相同；在加入下一種dNTP前有一個沖洗步驟(washing step)將上輪反應殘留物完全沖走，不會有抑制性產物的堆積。

通常情況下，人們所說的焦磷酸測序法指的是液相焦磷酸測序法，因為其四酶反應系統使得焦磷酸測序可以很方便地在單管中實現。

Ronaghi等利用dATPαS替代dATP提高焦磷酸測序的信噪比(Ronaghi M.et a1.Real-time DNA sequencing using detection of PPi release；Anal.Biochem，1996，242(1)：84-89)。因為dATPαS可以比dATP被DNA聚合酶更有效地利用，更有利于閱讀富含T的區域。dATPαS是兩種異構體Sp-dATPαS和Rp-dATPαS的混合物，聚合酶只能利用Sp-dATPαS。為了得到最佳反應效率，必須在反應體系中保持最佳濃度的Sp-dATPαS，與此同時Rp-dATPαS的濃度也在增加。dATPαS被Apyrase降解后仍會產生熒光素酶的抑制物，因此dATPαS的加入并沒有提高讀序能力。

Gharizadeh等人對此進行了改進，他們在反應中只加入純的Sp-dATPαS，而不加入無用的Rp-dATPαS，提高了反應的效率，大大降低了抑制產物的濃度，使得熒光素酶能夠維持較長時間的活性，使焦磷酸測序法的測序長度增加到50bp～100bp，測序長度的增加也使得焦磷酸測序技術有了許多新的應用(Gharizadeh B.et al.，Long-read pyrosequencing using pure2’-deoxyadenosine-5’-0’-(1-thiotriphosphate)Sp-isomer；Anal Binchem，2002.301：82-90)。

在2000年舉辦的第十二屆基因組測序和分析會議(12th International Genome Sequencing and Analysis Conference)上，Ronaghi等人提出了一種移除抑制產物、減小稀釋效應的方法，將測序長度增加到200bp。

與sanger雙脫氧鏈終止測序法相比，焦磷酸測序法具有快速、準確、經濟、實時檢測的特點；它不需要凝膠電泳，也不需要對DNA樣品進行任何特殊形式的標記和染色，具有很高的可重復性；能實現高度的并行性和高度的自動化。

二、焦磷酸測序技術的應用進展

1在單核苷酸多態性研究中的應用

單核苷酸多態性(Single Nucleotide Polymorphisms，SNPs)是近年來出現的第三代遺傳標記，它指在基因組內特定核苷酸位置上存在兩種不同的堿基，其中最少的一種在群體的頻率不小于1％。SNPs是生物的基因組中最為常見的遺傳多態型，它可以在任何一個待研究基因的內部或附近提供一系列標記；而正是這種基因組中的多態性，即基因組序列的差異構成了不同個體與群體對疾病的易感性、對藥物與環境因子不同反應的遺傳學基礎。

SNP的研究主要包括兩個方面：一是SNP數據庫的構建，主要是發現特定種類生物基因組的全部或部分SNP。二是SNP功能研究，發現SNP只是SNP研究的第一步，SNP功能的研究才是SNP研究的目的。Sanger測序技術已成為大規模、準確、快速發現SNP的主流技術。而對數據庫中已有SNP進行序列驗證分析和頻率分析，擅長短序列測序和驗證的焦磷酸測序技術是很好的選擇，采用焦磷酸測序技術進行SNP研究，更可以節約時間并降低消耗。

Nordfors等分別采用Taqman熒光定量法和焦磷酸測序技術對高達1022個樣本進行SNP基因分型研究，獲得了相同的結果，此對照實驗表明焦磷酸測序技術是進行高通量、大樣本的SNPs的高效、高準確度的方法。Wasson等利用焦磷酸測序技術來進行DNA池(DNA pools)的SNP等位基因頻率分析。Rickert等采用焦磷酸測序技術對4倍體馬鈴薯進行基因型研究，在對94個多態性位點檢測中，有76個等位基因位點可用焦磷酸測序技術鑒別，有效率達81％。蔣思文等利用焦磷酸測序技術進行了鑒別豬線粒體細胞色素b基因單倍型的工作。袁建林等利用焦磷酸測序技術進行HLA-DRB基因型分析研究，實驗表明，將焦磷酸測序結果與HLA數據庫的基因序列比較后可準確進行基因分型，該方法可應用于臨床器官移植的供體/受體篩查。

2在病原微生物快速鑒定中的應用

Jonasson等用焦磷酸測序技術檢測病原菌16S rRNA基因，快速鑒定出臨床標本中抗生素抵抗菌。Monstein等用焦磷酸測序技術成功檢測幽門螺桿菌16S rRNA基因易變的V1和V3區序列，證明該技術可滿足對臨床病原菌標本的快速鑒定和分型。Unnerstad等利用該技術對106株不同血清型的單核細胞增生李斯特氏菌進行了分型，利用焦磷酸測序技術在短時間內完成大量的樣本測序，其并行性和高效率非常顯著。Gharizadeh等用此技術對67個人乳頭瘤病毒樣品進行了鑒定和分型，證明該技術也非常適于HPV等病原體的大規模鑒定、分型和突變的研究。程紹輝等從感染人SARS病毒的Vero-6細胞中提取病毒RNA，采用焦磷酸測序技術對多個堿基突變位點測序和突變頻率分析。通過測序分析多個可能出現突變的位點，確定了該病毒為北京流行株。

3在病因學研究中的應用

Kittles等利用焦磷酸測序技術，對尼日利亞人、歐洲裔美國人和非洲裔美國人三個不同種群的CYPl7基因多態性進行分析，研究非洲裔美國人的CYPl7基因多態性與前列腺癌之間的關系和臨床表現。研究結果表明，序列為CC的CYPl7基因型的非洲裔美國人比序列為TT的CYPl7基因型非洲裔美國人患前列腺癌的幾率要高，證明這類人群中的堿基為C的CYPl7基因多態性與前列腺癌的發病率關系密切，為高危人群。眾多線索表明，位于染色體22q11的COMT基因與精神分裂癥的發病存在重要聯系，而科學家的研究工作一直沒能提出有力的證據；Shifman等提出了一種有效的方法，他們利用焦磷酸測序技術，對大樣本的德系猶太人群進行相關的單核苷酸多態性分析，證實精神分裂癥的發生與CMOT基因之間存在高度的關聯。這種方法也能適用于其他疾病的基因分析研究。

4在法醫鑒定中的應用

用Sanger測序法對線粒體DNA(mtDNA)變異分析，不能實現對由含有污染物、多個個體DNA等組成的mtDNA混合物的精確量化分析，而Andreasson等提出了一種針對mtDNA混合分析的基于焦磷酸測序技術的新穎的量化方法，可以很容易地從法庭證物混合樣本中快速、準確地檢測出主要的和次要的mtDNA成分。Balitzki-Korte利用焦磷酸測序技術對線粒體12S rRNA基因進行測序分析，在149bp長度的基因片斷上進行長度為20bp的檢測，通過參考數據庫序列，就能夠充分確定對象的生物學起源，比如說，能夠確定一塊皮膚組織究竟是來自失蹤人員還是動物身上。

三、焦磷酸分析裝置及發展

焦磷酸測序技術的應用依賴于焦磷酸分析裝置的研究與開發。不論何種焦磷酸分析裝置，其主要結構都應包含兩個部分：反應器部分和微弱光檢測部分。反應器提供反應進行的場所，微弱光檢測部分負責檢測反應發出的可見光。在人們對焦磷酸測序技術的研究和應用過程中，設計和使用的反應器主要可以分為3類：微量板反應器、微流控芯片反應器和微陣列芯片反應器。

而商業化的焦磷酸測序儀在國外已面世，然而國內相關儀器本身研究的報道甚少，更無相應的產品問世。國外產品的一個典型代表是Pyrosequencing AB公司的PSQ96，它是該公司2001年推出的產品，系統能夠同時進行96路或者384路DNA樣本的獨立測序，當測序長度不超過300bp時一般所用時間在1小時45分鐘，準確性和可靠性達到99％，具有高通量、快速、經濟的優勢。PSQ96系統已經廣泛用在基礎醫學研究和臨床分子診斷當中。

國外儀器研究另外一個代表是美國454 Life Science公司2005年推出的Genome Sequencer20(GS20)。它走向了有著更高技術含量的微型化方向，即利用MEMS技術將微濾腔作為焦磷酸測序反應的反應環境，將驚人的上百萬數目的反應陣列集成進7cm×8cm的面積內，并使每個反應艙能獨立同時進行測序級聯反應，儀器具有的高靈敏度和分辨率的CCD能夠捕捉到每個單反應艙產生的微弱熒光信號，最終能夠得到每個標本DNA的序列信息。GS20僅需4.5個小時即可實現高密度測序反應，經過并行計算得到每個標本的序列信息。優點是可以節省反應試劑的消耗，降低測序成本，為基因組大規模測序提供可能。

目前國內的儀器研究剛剛起步，國產化的道路漫長，面對方方面面的問題，在權衡測序系統所需要的各種硬件條件后，發現首要面對的問題和挑戰是微量加樣子系統的研制問題。

四、焦磷酸測序中加樣系統的重要性

焦磷酸測序技術及其產品為大通量、低成本、適時、快速、直觀地進行單核苷酸多態性研究和臨床檢驗提供了非常理想的技術操作平臺，是后基因組時代進行基因序列分析研究的有力工具。焦磷酸測序技術正被越來越多的研究人員接受和采用，隨著國際上焦磷酸測序技術應用的興起和商品化焦磷酸測序儀器的發展，我國的焦磷酸測序技術應用方興未艾。但是在現階段，國內焦磷酸測序技術的應用和推廣存在幾個制約因素：(1)現有的商品化焦磷酸測序儀器如PSQ96、GS20價格昂貴；(2)商業化的焦磷酸測序服務等待時間長且很不方便；(3)雖然目前有些實驗室在進行諸如焦磷酸測序芯片等裝置的研究，一些實驗室有自制的、結構簡單的焦磷酸測序試驗裝置，但國內沒有面向低端的、價格便宜的、商品化的基于焦磷酸測序技術的序列檢測儀器，是制約焦磷酸測序技術應用發展的關鍵問題。

焦磷酸測序系統是在微量環境中進行的，通常反應體系僅在50μL，所需的反應底物、DNA模板以及脫氧核苷酸等試劑的量非常微小；同時，單次加樣量的多少直接影響循環反應的可持續性，過大的單次加樣量會使反應溶液體積迅速變大，因此造成模板濃度下降過快。由于擴散作用產生的反應延遲非線性增加，得到的微弱熒光信號在時間軸上延伸，強度在縱坐標上降低，最終導致嚴重縮短核酸的可測序長度。一般認為由于后續加樣造成的反應體系增加如果在10％之內，對實驗結果的影響是在可以接受的范圍內。假如要對一段20bp長度的DNA片斷進行測序，那么在50μL的反應體系中，允許的單次加樣量只能不超過0.3μL。

此外，除了加樣精度，加樣間隔的時間準確性也同樣重要。只有在等時間間隔內加入單循環所需的dNTP，才能使每次的殘留dNTP的降解程度相當，那么對下次反應造成的影響也將相等。等時間段才能給每個周期的信號提供基準，便于后續根據熒光信號強度計算核苷酸結合數目的自動化分析。

雖然國產化的加樣設備已比較豐富，但是國內現有的微量加樣裝置都有不足。比如上海復日的加樣平臺，作為大型自動化樣本池處理設備，能夠進行標準96孔板的加樣、振蕩、清洗工作，但是這套系統由于噴嘴加工工藝的限制，加樣微精度最小只有1μL，無法滿足焦磷酸測序要求的nL級別。經過調研，限制于國內應用和制造水平，國產化的加樣裝置都無法滿足焦磷酸測序中對加樣量以及重復精度的高要求。

東南大學葛健徽等公開了一種以微弱光檢測模塊和微量dNTP加樣模塊為關鍵模塊的液相焦磷酸分析裝置，其中公開了一氣壓控制微量dNTP加樣模塊，可實現96路dNTP溶液的同時加樣，最小加樣量為1.2μL，最大誤差為13％；但信號噪聲較大，仍需更一步改進(葛健徽等，基于焦磷酸測序的基因檢測裝置的研制，東南大學，碩士學位論文，2006)。

王春林等公開了一種采用壓電陶瓷噴頭的焦磷酸核酸測序儀中微量加樣系統，該可以在步進電機驅動下，對96孔標準板樣本分別進行4種dNTP試劑的輪流加樣，加樣重復精度大于95％，單次加樣最小量能達到0.lμL。上述兩類較佳的焦磷酸核酸測序儀中所用的微量加樣系統結構比較復雜，且加樣針易堵，dNTP通過不同的方式噴入測序反應液內并不與反應液接觸使得與反應液混合不充分反應不完全，對dNTP要求量也較高且數據易不準確；此外，拆裝麻煩，成本高且不利于特殊條件下應用。

焦磷酸測序(preosequencing)技術是近年來發展起來的一種新的DNA序列分析技術，它通過核苷酸和模板結合后釋放的焦磷酸引發酶級聯反應，促使熒光素發光并進行檢測。是一個理想的遺傳分析技術平臺，既可進行DNA序列分析，又可進行基于序列分析的單核苷酸多態性(SNP)檢測及等位基因頻率測定等，該項技術目前已被廣泛應用于醫學生物等各個領域。

焦磷酸測序是由DNA聚合酶(DNA polymerase)、三磷酸腺苷硫酸化酶(ATP sulfurylase)、熒光素酶(luciferase)和雙磷酸酶(apyrase)4種酶催化同一反應體系的酶級聯化學發光反應，反應底物為5’-磷酰硫酸(adenosine 5’phosphosulfate，APS)和熒光素。反應體系還包括待測序DNA單鏈和測序引物。在每一輪測序反應中，加入1種dNTP，若該dNTP與模板配對，聚合酶就可以將其摻入到引物鏈中并釋放出等摩爾數的焦磷酸基團(PPi)。硫酸化酶催化ASP和PPi形成ATP，后者驅動熒光素酶介導的熒光素向氧化熒光素的轉化，發出與ATP量成正比的可見光信號，并由Pyrogram^TM轉化為一個峰值，其高度與反應中摻入的核苷酸數目成正比。根據加入dNTP類型和熒光信號強度就可實時記錄模板DNA的核苷酸序列。在實驗過程中用α-硫化的三磷酸腺苷(dATPαS)代替三磷酸腺苷(dATP)以有效地被DNA聚合酶利用，而不被蟲熒光素識別。由于SpdATPαS可以降低dATPαS降解產物的濃度，近年來，單鏈DNA結合蛋白(single starnd DNA binding portein，SSBP)和純化Spisomer dATPaS的使用dATPαS降解產物抑制雙磷酸酶活性的這一問題得到較好解決，使得測序長度可達10bp，拓展了該技術在遺傳學領域的應用范圍。

焦磷酸測序中，通過使用階段性互補鏈合成反應和化學發光反應，檢測發光，從而來確定DNA序列。將含有由互補鏈合成產生的焦磷酸和剩余的核酸底物的反應液從而進行互補鏈合成的反應槽移動到另外的反應槽，進行發光反應，并在反應液移動的過程中通過固定有分解剩余的核酸底物的酶的區域，將剩余的核酸底物分解后，使焦磷酸轉化為ATP，導入化學發光反應槽。但現有技術的弊端是必須加入大量的底物和酶進行反應，以保證反應可以完全進行，之后需要再反應掉多余的底物后清洗，這不僅增加了反應過程，增大了每一步的清洗及反應難度，還會對底物等試劑造成很嚴重的浪費，反應時間長，浪費人力物力，無形中降低了焦磷酸測序在市場中的推廣和使用潛力。

目前應用于焦磷酸測序的儀器多為部分廠家壟斷制造和銷售，儀器與試劑均為配套銷售，測序時成本十分昂貴，檢測維修過程均需依賴于特定的技術人員，周期長成本高，反應所需的體積較大，更加大了反應的成本，檢測結果不穩定，重復精度低。因此設計自主研發開發一款適用于焦磷酸測序的DNA測序儀是十分有必要的。

五、DNA單鏈分離技術概況

DNA單鏈分離技術是生物醫學領域中最常見的分離技術之一，適用于不同核酸樣品的DNA各種規模測序及探針設備，廣泛地應用于生物學、醫藥學、預防醫學、動植物學、農牧業、食品與衛生、能源與化工、環境監測以及醫學診斷與檢測等領域。此外，DNA單鏈的吸附、提取與分離技術在水質、水源、生物材料、生物體液(如血液、血清、血漿、腦脊液、尿液、淚液、汗液、消化液、精液、分泌液、組織液、嘔吐物、糞便)、組織/細胞和微生物裂解液、不同來源的蛋白、核酸等生物、化學分子以及藥物等的分析檢測、分離和純化以及寡核苷酸、多肽、先導化合物和藥物的合成等方面被廣為應用，與人們的日常生活息息相關，在生物醫藥領域具有舉足輕重的地位。

生物醫藥領域中常用的DNA單鏈分離方法并存在的不足如下：

1.熱變性或堿處理。該種方法主要是將雙鏈PCR產物進行加熱或堿處理，由于DNA雙鏈在高溫或一定程度的堿性環境下氫鍵會斷裂，使得DNA變為單鏈。雖然該種方法原理可行，操作簡單，但該種方法由于其分離率和純度較低而逐漸不作為單鏈DNA的純化，多用于DNA的雙鏈分離。

2.T7逆轉錄法。該種方法是在一條PCR引物5’端加上T7啟動子，以純化PCR擴增產物為模板，用T7RNA聚合酶體外逆轉錄合成單鏈RNA(Hughes,et.al.,Nat.Biotechnol.,2001,19：342-347)。該種方法雖然原理可行，DNA單鏈分離率較高，且獲得的DNA單鏈純度較高，但整個分離過程需分為兩大步驟完成，操作不便，時間較長，而且需嚴格控制RNA酶的污染，故具有一定的局限性。

3.核酸外切酶法(Higuchi and Ochman,Nucleic.Acids Res.,1989,17：5865)。由于一條PCR引物被磷酸化，PCR產物在用核酸外切酶消化時，被磷酸化的引物擴增鏈不被切割，消化后酶被加熱滅活。該種方法也需純化PCR產物，分離程序冗長，操作亦十分不便，而且DNA單鏈獲得率依賴于外切酶的活性，不可控因素過強，實驗結果的穩定性不夠；因此，該種方法的推行率不廣，通用性不高。

4.變性高效液相色譜法(denaturing high-performance liquid chromatography，DHPLC)。在部分變性的條件下，通過雜合與純合二倍體在柱中保留時間的差異，發現DNA突變。異源DNA雙鏈與同源DNA雙鏈的解鏈特性不同，在部分變性條件下，異源雙鏈因有錯配區的存在而更易變性，在色譜柱中的保留時間短于同源雙鏈，故先被洗脫下來，在色譜圖中表現為雙峰或多峰的洗脫曲線。由于一條PCR引物被生物素標記，其PCR擴增鏈在DHPLC時，會與另一條普通鏈分開(Dickman and Hornby,Anal.Biochem.,2000,284：164-167)。該方法可以在15min內直接從雙鏈PCR產物中獲得所需的DNA單鏈，但該種方法的實施需要配套十分昂貴的儀器，故始終難以普及。

5.磁珠捕獲法。運用納米技術對超順磁性納米顆粒的表面進行改良和表面修飾后，制備成超順磁性氧化硅納米磁珠。該磁珠能在微觀界面上與核酸分子特異性地識別和高效結合。利用氧化硅納米微球的超順磁性，在Chaotropic鹽(鹽酸胍、異硫氰酸胍等)和外加磁場的作用下，能從血液、動物組織、食品、病原微生物等樣本中的DNA和RNA分離出來，然后用NaOH處理得到目標單鏈。該種方法操作簡單、用時短，整個提取流程分為四步，大多可以在36-40分鐘內完成，且安全無毒，不使用傳統方法中的苯、氯仿等有毒試劑，對實驗操作人員的傷害減少，符合現代環保理念，磁珠與DNA單鏈的特異性結合使得提取的DNA單鏈純度高、濃度大，但該種方法中使用的包被磁珠較為昂貴，且需要依靠磁力架分離，不僅分離成本較高，還不方便，故在一定程度上限制了該技術的推廣。

6.不對稱PCR。以上方法均需在PCR后進行額外的處理，而不對稱PCR可在PCR擴增的同時制備DNA單鏈。常規不對稱PCR使用兩條不等量的引物，在開始的循環里進行正常擴增。隨著循環的增加，量少的引物被逐漸耗盡，而超量的引物可繼續直線擴增生成DNA單鏈(Gyllensten and Erlich,Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.,1988,85：7652-7656)。該種方法具有較高的雜交靈敏度和特異性，且操作簡便性更強，但其引物的比例需要優化，而且非特異擴增的機會增加，此外，DNA單鏈分離過程需要依靠電泳，分離程序復雜，且電泳時常可見彌散條帶，其耗時和不便是顯而易見的。

上述幾種分離方法均具有一定的局限性，因此，為了滿足對DNA單鏈分離的可操作性及經濟性要求，現有技術中的DNA單鏈采用的是集成化的提取工作站，將帶有鏈親和素的親和連接體與DNA雙鏈結合，工作站具有抽濾針及配套的泵，結合后的DNA親和連接體通過抽濾吸附在抽濾針內濾膜下部，工作站配有軌道及相關系統，抽濾結束后將抽濾針移至盛有NaOH的盤中，通過堿處理解雙螺旋，得到DNA單鏈，再次抽濾后清洗收集。抽濾針一般24根(4*6)為一組，使用時必須保證有足夠量的樣品或試劑以保證工作站的正常運行，因此這種DNA單鏈的收集方式十分的不靈活，只能以固定量加入工作站進行工作，且大量的損失在多次的抽濾及轉移過程中產生，這對微量收集十分不利，并且抽濾針組需要同時進行工作，這對工作站各部件都具有一定的體積要求，整個工作站占用空間很大。龐大的系統使得在DNA單鏈分離操作過程中，微分離柱需要來回反復移液，操作十分繁瑣，不僅分離周期長、效率低，且整體設備價格較貴，導致DNA單鏈分離的費用高，還需要耗費大量的試劑及其他資源，極不經濟。此外，該工作站中抽濾針為金屬材質，價格昂貴，往往是處理后再重復使用，故易導致殘留物之間的交叉污染，可靠性不高，對分離及檢測結果的準確性均會造成一定的干擾和影響。且溶液抽取過程中會有部分殘余溶液貼壁，使得一定量的目的DNA單鏈不能被微分離柱吸附，導致獲得的DNA單鏈比例降低，影響了分離率，造成了浪費。因此，用于焦磷酸測序的高質量高效率的DNA單鏈分離問題亟待解決。

技術實現要素：

針對現有技術存在的上述問題，本發明的目的是提供一種操作簡便、快速檢測的核酸測序裝置。

為實現上述發明目的，本發明采用的技術方案如下：

一種核酸測序裝置，包括樣品區、反應區、檢測區和控制區；

所述樣品區包括電泳儀和可旋轉的分離盤，所述分離盤位于反應區的上方，所述分離盤包括至少一個DNA分離區，所述分離區包括內部設有濾膜的中空的過濾柱，連有親和連接體的DNA單鏈和未連接親和連接體的DNA單鏈經所述濾膜過濾后分離；

所述反應區包括加樣部和樣品槽，所述加樣部包括dNTP試劑槽、加樣針架和安裝于其上的多個加樣針，所述分離盤位于試劑槽的側上方；所述加樣針架位于樣品槽上；所述樣品槽上設有多個槽位；

所述檢測區包括生物發光檢測裝置，所述槽位與生物發光檢測裝置連接；

所述控制區包括微型計算機、光控制系統、位置控制系統、環境控制系統、活性檢測系統和驅動控制系統；

所述樣品區、反應區和檢測區安裝在分析臺上，所述樣品區、反應區和檢測區通過控制區監測、控制。

作為上述技術方案的進一步改進：

優選地，濾膜設于過濾柱的一端。換言之，濾膜構成了過濾柱的底端，DNA分離區的過濾面設于分離柱底，也就是說分離后的單鏈DNA在濾膜上。

進一步，作為一種優選的實施方式，過濾柱的外徑等于收集管的內徑，通過摩擦力可使過濾柱與收集管保持在一個相對穩定的狀態，不需要外加結構為過濾柱進行限位固定。

另一種優選的方式，所述分離盤設有多個收集管，所述過濾柱安裝于收集管中，所述濾膜位于過濾柱的非端部。

進一步，所述濾膜為高分子納米微球結構，所述高分子納米微球間的孔徑小于親和連接體的直徑。

進一步，所述收集管設有可拆卸的上蓋，所述上蓋通過連接帶與收集管連接。

分離后的單鏈DNA在濾膜上為連接有親合體的單鏈，需要該條鏈可對濾膜進行洗脫，濾液中含有不帶親和連接體的另一條互補鏈，需要反向測序時可對濾液內的單鏈DNA進行收集。當需要收集濾膜上的帶親和連接體的一條鏈的時候，收集管可采用回收的收集管，此時收集管僅起到回收廢液的作用，回收使用降低成本，并且環保減少白色污染的產生。

優選地，所述試劑槽設有多個反應位，所述試劑槽的側下方設有底物供給部，所述底物供給部通過輸送管道向反應位輸送dNTP的dATP、dCTP、dGTP、dTTP四種核酸底物。

優選地，所述加樣針架為圓盤形，所述加樣針架通過移動部可沿試劑槽和樣品槽之間做往復運動；所述加樣針架通過轉軸做旋轉運動。

優選地，所述移動部包括通過安裝架固定在分析臺上方的滑軌，所述加樣針架底端的滑塊。

優選地，所述轉軸設有驅動電機。

優選地，所述加樣針為實心針，所述加樣針固定于加樣針架的通孔中。

優選地，所述加樣部還包括干燥槽和清洗槽。

優選地，所述槽位沿樣品槽的圓心呈一系列同心圓均勻排列，所述槽位由透明材質構成，所述槽位延伸入生物發光檢測裝置。

優選地，所述生物發光檢測裝置包括固定殼和相機，所述相機可旋轉的位于固定殼中，所述相機位于所有槽位湊成的中軸線上。

優選地，所述電泳儀內設有凝膠平臺和發光二極管，所述凝膠平臺上設有瓊脂糖珠。

優選地，所述控制區的環境控制系統包括對溶液濃度和PH值的控制。

優選地，所述分析裝置還包括機械手，所述機械手位于分析臺的一側。

針對現有技術存在的上述問題，本發明核酸測序裝置的優勢是：

(1)將DNA單鏈通過過濾離心的方式來進行提取，實現了一樣品一收集的經濟化小型化收集，提供了一種高效低損失的快速DNA單鏈分離方法及裝置。本方法簡單易操作，獲取目標樣品時間短效率高，可用于痕量DNA單鏈的收集與提取，樣品損失幾乎可以忽略，使用試劑少、對設備的要求低，在分離過程無需抽水泵，大大簡化了設備配置，降低了設備總成本，有效簡化了操作步驟，縮短了操作時間，降低了工作強度，提高了工作效率；采用與常規離心管配套的過濾柱不僅保證了分離的質量及效率，也使得分離過程簡單易實現，過濾柱的濾膜通過物理方式對DNA單鏈進行分離，降低了分離的難度及條件要求。濾膜由均質的材料以相同結構組成，可雙向調換使用，增大了過濾柱的設計可能性，不僅可以制作為一端帶有濾膜的中空結構，豐富DNA單鏈分離裝置的結構及種類，在確保相同功能的前提下，增加了本發明的DNA單鏈分離裝置的運用場合，避免了產品結構單一，適應性顯著增強；而且可以采用上下對稱結構，可上下調換配合使用。本DNA單鏈分離裝置采用價格低廉的PC塑料，經濟且實用，漏斗形內腔的設計，有利于反應液的聚集與引導，使得反應液分離更充分更完全，獲得了較高比例的目的DNA單鏈，保證了較高的分離率，避免了浪費。此外，本DNA單鏈分離裝置還適用于市售離心管，標準化設計，使得本DNA單鏈分離裝置通用性極強，適用面極廣，因此其應用前景十分廣闊。

(2)本發明采用一結構簡單的加樣針即可實現dNTP試劑的微量給樣，摒棄了傳動的中空針管抽噴式的給樣方式，僅通過所述加樣針的加樣針與液體間的吸附力及其在不同液體中的移動速度差異的控制即可實現微量取樣加樣，且僅通過加樣針在測序反應液內上下運動數次即可實現攪拌使得酶反應更為完全結果準確，本加樣方法及其裝置適用于任何檢測裝置中，拆卸簡便，清洗簡單便捷，且不會發生堵針等多種現有技術中的加樣裝置的不足，加樣重復精度大于95％，且最小加樣量可達0.1μL，加樣均一性好，測序時間大為縮短且結果準確性極高；此外可通過所聯用的檢測裝置對樣品核酸序列進行定性定量檢測；因此其應用前景十分廣闊。

(3)本發明的核酸測序裝置，采用機械手操控整個過程，無感染，準確率高，提高了了效率和精度。

總之，本發明提供的核酸測序裝置減少了底物及酶系的用量，檢測準確，反應速度快，集成化高，且可以同時檢測一至多個SNP位點以及單鏈DNA片段，酶系及底物均打破了部分生產商的壟斷，價格大大下降，分析裝置結構精密，對待測DNA片段及底物的用量要求低，降低了焦磷酸測序的檢測成本，擴大了焦磷酸測序的使用范圍。

附圖說明

圖1是本發明的核酸測序裝置的結構示意圖。

圖2是本發明控制區的結構示意圖。

圖3是本發明提供的用于焦磷酸的DNA分離區的一使用優選實施例。

圖4是本發明實施例1中過濾柱的結構示意圖。

圖5是本發明實施例2中過濾柱的結構示意圖。

圖6是本發明實施例3中過濾柱的結構示意圖。

圖7是本發明實施例4中過濾柱的結構示意圖。

圖8為本發明提供的用于焦磷酸測序系統的加樣裝置結構中的加樣針示意圖。

圖9為實施例中采用本發明提供的用于焦磷酸測序系統的加樣裝置測得的序列譜圖。

圖中標號說明：

1、電泳儀；2、分離盤；21、過濾柱；211、分離通道；22、濾膜；23、收集管；231、上蓋；232、連接帶；3、樣品槽；31、槽位；4、加樣針架；41、加樣針；42、轉軸；5、生物發光檢測裝置；51、固定殼；6、分析臺；61、安裝架；62、滑軌；7、試劑槽；71、干燥槽；72、清洗槽；73、底物供給部；74、反應位；8、輸送管道。

具體實施方式

下面結合實施例對本發明作進一步詳細、完整地說明。

實施例1

圖1至圖3示出了本發明核酸測序裝置的第一種實施方式。本發明核酸測序裝置，可用于焦磷酸測序檢測分析DNA序列，待測序的DNA序列為靶序列，將靶DNA序列進行擴增后進行焦磷酸測序。

本實施例的核酸測序裝置包括樣品區、反應區、檢測區和控制區。樣品區、反應區和檢測區安裝在分析臺6上，樣品區、反應區和檢測區通過控制區監測、控制。整個分析過程采用機械手操作。

樣品區包括電泳儀1和分離盤2。電泳儀1內設有凝膠平臺和發光二極管，凝膠平臺上設有瓊脂糖珠。進行焦磷酸測序之前，需要先對帶測序的DNA模板進行擴增，以達到擴增要求的DNA濃度。擴增引物設計時，擴增引物上帶有親和連接體，親和連接體優選為生物素，親和連接體優選地標記在靶DNA的一端引物上，PCR擴增采用現有技術進行即可。

分離盤2位于反應區的上方，在靶DNA擴增后，靶DNA為雙鏈DNA，焦磷酸測序需要單鏈DNA，分離盤2包括至少一個DNA分離區，DNA分離區采用物理過濾的方式，分離區包括內部設有濾膜22的中空的過濾柱211，濾膜22為高分子納米微球結構，由于高分子納米微球間的孔徑小于親和連接體的直徑，將帶有親和連接體標記的DNA單鏈留在膜上，根據測序需要收集帶標記的DNA單鏈或其互補鏈，用于焦磷酸測序。

本實施例中，分離盤2設有多個收集管23，過濾柱21安裝于收集管23中，濾膜22位于過濾柱21的一端的端部。過濾柱21下段的外徑與收集管23的內徑相同。

雙鏈DNA在堿解后將待親和連接體的一條鏈留在濾膜22上，收集該條鏈只需在過濾柱21內加入收集液后收集；如需收集互補鏈，可將濾液收集后對濾液中的互補鏈進行收集。

如圖3所示，收集管23用于收集離心時產生的廢液，每個步驟后需要及時傾倒以防止交叉污染，收集管23的上端管身為圓柱體、下端為圓錐體，底部為球面狀。作為另一種優選的實施方式，收集管23配置上蓋231，上蓋231通過連接帶232可拆卸地連接在收集管23上，由于連接帶232的連接，裝入過濾柱21后上蓋231也可緊密扣合在過濾柱21或收集管23上，上蓋231的作用是在液體離心時防止液體飛濺出過濾柱21造成損失及污染。

本實施例中所優選的濾膜22材料為聚乙烯微球，其微球間孔隙優選為10μm，小于親和連接體的直徑，可直接通過物理過濾將帶有親和連接體的單鏈留在膜上，濾去未連接親和連接體的一條鏈，其吸附洗脫效果好，DNA回收率高，原料價格低廉環保。

如圖4所示，為了本實施例中的濾膜22在吹打或離心過程中不發生移動，本實施例中還優選的在濾膜22上方設有壓膜裝置，壓膜裝置包括墊片和/或壓膜架。待分離純化的液體先通過墊片后與濾膜22接觸，墊片優選為纖維材料，可耐受酸堿和大部分有機溶劑，對大部分的生物分子不會產生吸附。

優選地在墊片的上方，不與濾膜22接觸的一側，還設有壓膜架，壓膜架與過濾柱21體材料相同，通過機械壓力壓緊濾膜22，使濾膜22不會在吹打或離心等使用過程中發生移動，造成收集損失。

反應區包括加樣部和樣品槽3，加樣部依次包括dNTP試劑槽7、干燥槽71、清洗槽72、加樣針架4和安裝于加樣針架4上的多個加樣針411。分離盤2位于試劑槽7的側上方。加樣針架4為圓盤形，加樣針架4通過移動部可沿試劑槽7和樣品槽3之間做往復運動。移動部包括通過安裝架61固定在分析臺6上方的滑軌62以及加樣針架4底端的滑塊。干燥槽71為真空干燥區。

試劑槽7設有四個反應位74，試劑槽7的側下方設有底物供給部73，底物供給部73通過輸送管道8向反應位74輸送dNTP的不同核酸底物。待測反應位74用于盛放待測序的DNA序列，底物供給部提供dNTP，與靶DNA雜交反應，為雜交反應提供環境基礎。用于焦磷酸測序的dNTP包括dATP、dCTP、dGTP、dTTP四種核酸底物，底物用于與靶DNA雜交，并且需要在反應體系中加入相關酶系催化反應進行，具體為DNA聚合酶，進行互補鏈合成反應，在互補鏈合成時得到的副產物焦磷酸轉化成ATP，在螢光素酶存在下使ATP和螢光素反應，進行發光。如果發生互補鏈合成，則產生焦磷酸，結果發光，因此通過對其進行監視，可以得知產生互補鏈合成，即組入的堿基種類，由此確定DNA序列。

加樣針架4通過轉軸43做旋轉運動，轉軸43設有驅動電機。加樣針411為實心針，用于轉移dNTP試劑，加樣針411固定于加樣針架4的通孔中。將DNA單鏈按照反應體系的需要量轉移至反應位74中，加入酶系后依次加入dNTP，加入順序不限，對于每個位點，四種底物各加入一次，底物由底物供給部73提供。

檢測區包括生物發光檢測裝置5，槽位31與生物發光檢測裝置5連接。反應后如合成互補鏈，則發光，生物發光檢測裝置5用于檢測判斷該位點是否進行反應并發光，進而判斷出該位點的堿基序列。

加樣針架4位于樣品槽3上；樣品槽3上設有多個槽位31，槽位31中有測序反應液。槽位31沿樣品槽3的圓心呈一系列同心圓均勻排列，槽位31由透明材質構成，槽位31延伸入生物發光檢測裝置5。生物發光檢測裝置5包括固定殼51和相機，相機可旋轉的位于固定殼51中，相機位于所有槽位31湊成的中軸線上。相機為市售iKon-M深度制冷影像CCD相機，且連接電腦并呈現檢測的譜圖。

如圖8所示，加樣針41的端面為半圓體；采用上述的加樣裝置檢測已知序列的樣品(序列為CAATATTCGCCAGGT)，其中加樣針41直徑為1.5mm，表面光潔度為Ra 0.8；加樣方法包括：步驟a，通過加樣針41插入樣品槽3的dNTP試劑使得加樣針41外周附著所述dNTP試劑；步驟b，將附著所述dNTP試劑的加樣針41插入槽位31中，再使加樣針41離開測序反應液；所述步驟a中所述加樣針41離開所述dNTP試劑液時的移動速度為10cm/s，所述步驟b中所述加樣針41離開所述測序反應液時的移動速度為1cm/s，在測序反應液內上下運動8次后離開測序反應液。

圖9為本實施例的加樣方法及其裝置聯用焦磷酸核酸測序檢測裝置所得的測序譜圖，由圖9可知，其中依次加入dNTP的順序TCATATTCGCCAGT，其中首次加入T時未出峰，以及后續與實際序列不符的dNTP試劑液也未出峰(圖9中用圓圈標出，即T、T、C)，其測得的序列為CAATATTCGCCAGGT，與樣品實際序列完全一致，精確度為100％，檢測單個堿基的時間小于1.5分鐘，此序列大約耗時25分鐘，且最小加樣量可達0.1μL。

本發明的核酸測序裝置的設置方式可以更好地傳遞底物與DNA，減少傳遞過程中的損耗。

反應區的形狀不限，分析裝置內的具體結構可以根據檢測的需要進行設計調整，任何可能實現焦磷酸測序的結構形狀及相對位置均應認為落入本發明的保護范圍之內。

底物加樣至反應區中，此時反應區中已加入待測DNA單鏈及其他所需反應體系內試劑，以檢測所需5ul的量計算，反應體系如下：

酶混合物包括：

底物混合物包括：

APS 0.4mg/L；

螢火蟲熒光素0.4mmol/L。

反應過程中，在每一步選擇對酶活性而言最適宜的pH值進行反應，反應后需要對反應體系內的pH值進行調整以適應其他反應，具體反應體系中的反應條件本領域普通技術人員可根據現有技術得出。例如，當洗滌步驟中包含腺苷三磷酸雙磷酸酶以去除過量核苷酸種類和ATP時，因為處理步驟的連續性，緩沖液可與腺苷三磷酸雙磷酸酶一起使用，其pH能使腺苷三磷酸雙磷酸酶潔性水平最佳化。然后，在下一個核苷酸摻入步驟中使用聚合酶，可使用具有對聚合酶而言的最佳PH條件的不同緩沖液，以便使聚合酶潔性最佳化。另外，每種最佳緩沖液可包括對于每種酶而言的優選抗衡離子，例如對于腺苷三磷酸雙磷酸酶緩沖液而言的Ca²⁺和對于聚合酶緩沖液而言的Mg²⁺。

如圖9所示，反應體系中，檢測序列為CAATATTCGCCAGGT，其中依次加入dNTP的順序為TCATATTCGCCAGT，其中首次加入T時未出峰，以及后續與實際序列不符的dNTP試劑也未出峰，其測得的序列為CAATATTCGCCAGGT，與樣品實際序列完全一致，精確度為100％；檢測單個堿基的時間小于1.5分鐘，此序列大約耗時25分鐘，且最小加樣量可達0.1μL。

測序結果通過生物發光來進行判斷，其他可以檢測生物發光的裝置均可使用為檢測裝置，在此不做限制。

本發明所述實施例中的基于焦磷酸測序的核酸測序裝置，還包括各樣品存儲裝置之間的液體供給及排出通道，液體供給通道用于輸送待反應的試劑及樣品，液體排出通道用于將反應結束后或者經過離心后的液體排出至收集部件。

控制區包括微型計算機、光控制系統、位置控制系統、環境控制系統、活性檢測系統和驅動控制系統。環境控制系統包括對溶液濃度和PH值的控制。

本發明的分析裝置中在反應中，需要保證各部操作均在最適宜的環境下進行，酶系需要在活性最高的反應體系中進行反應，以保證反應完全，因此控制區中設有可以保證這些反應能夠高效有序進行的若干組件，包括離心機、pH計、加溫組件、控制信號傳遞組件等測序設備的常備結構。

本發明所述實施方案的系統和方法可包括使用計算機可讀介質進行一些設計、分析或其它操作，這樣的介質存儲有用于在計算機系統上執行的指令。例如，處理所檢測信號和/或分析用測序結果系統和方法產生的數據的一些實施方案，其中處理和分析實施方案是在計算機系統上執行的。

用于本發明的控制區的一個示例性實施方案可包括任何類型的計算機平臺，例如工作站、個人計算機、服務器或任何其它現有或未來的計算機。計算機通常包括己知部件，例如處理器、操作系統、系統存儲器、記憶存儲裝置(memory storage device)、輸入輸出控制器、輸入一輸出裝置和顯示器。相關領域普通技術人員將會理解，有許多可能的計算機配置和部件，并且還可包括高速存儲器、數據各份單元和許多其它裝置。

顯示器可包括提供可視信息的顯示器，這樣的信息通常邏輯地和/或物理地組織成為像素陣列。也可包括界面控制器，其中可包括任何不同的己知或未來的軟件程序，用于提供輸入和輸出界面。例如，界面可包括所謂的″圖形用戶界面(Graphical User Interfaces，通常稱為GU I)″，其可為用戶提供一種或多種圖像顯示。使用相關領域普通技術人員己知的選擇或輸入方式，界面通常能夠接受用戶輸入。

在相同或替代實施方案中，在計算機上的應用可使用包括所謂“命令行界面”(通常稱為CLI)在內的界面。CLI通常提供基于應用與用戶間相互作用的文本。通常，命令行界面通過顯示器以文本行形式顯示輸出并接收輸入。例如，某些執行過程可包括所謂的″命令行解釋程序(shell)″例如相關領域普通技術人員己知的Unix命令行解釋程序(Unix Shell)，或使用面向對象型程序體系結構的Microsoft Windows Powershell，例如Microsoft.NET框架。

相關領域普通技術人員將會知道，界面可包括一種或多種GUI、CLI或其組合。

處理器通常執行操作系統，操作系統可選擇現有技術中的任何操作系統，只要本領域技術人員可用于處理檢測結果及數據等工作均認為可以納入保護范圍之內。

本發明中的基于焦磷酸測序的核酸測序裝置可以廣泛地用于DNA序列的確定、診斷、檢查，SNP位點的確定、診斷等，可實現一定樣本的同時測序，原理對測序的條件要求低，不需要額外增加激發光源及熒光劑等昂貴的實驗試劑，可實現簡便廉價的DNA測序工作，并且檢測結果穩定，準確率高，克服了以往設備不能充分進行或者互補鏈合成反應先過度進行的弊端，反應體積小，可以在更短的時間內完成反應階段的工作。

采用本發明提供的核酸測序裝置或系統的分析方法，包括以下步驟，其中未公開部分可參照現有技術：

(1)結合：將經過擴增后的DNA片段與瓊脂糖珠結合，DNA片段的長度為10～20kb，DNA最小上樣量應不小于500ng，瓊脂糖珠直徑為30μm，表面覆有生物素及鏈霉親和素，擴增后的DNA片段與鏈霉親和素包被的瓊脂糖珠自發地特異性結合；

(2)離心：吸取結合后的DNA雙鏈至過濾柱21中，過濾柱21預先裝入收集管23中，放入離心機后以12000rmp離心1min，去除多余溶劑；其中收集管23為1.5mL離心管；過濾柱21為上端開口、下端半封閉的圓柱體，過濾柱21上端開口外緣設有凸臺，以固定在收集管23上，過濾柱21下端內置有過濾膜22，過濾柱21直徑為4.5mm，濾膜22直徑為4.7mm，通過將濾膜22強行壓入過濾柱21中使之緊密貼合不留縫隙；

(3)洗滌：在加入適量70～80％的乙醇，洗去殘留的Taq酶等擴增試劑，輕輕吹打混勻后12000rmp離心1min；

(4)堿解：加入0.4M NaOH與1M NaCl解開雙鏈螺旋，輕輕吹打混勻后12000rmp離心1min；

(5)調pH值：加入適量洗脫buffer或超純水清洗，洗去殘留的NaOH，平衡pH值至中性，輕輕吹打混勻后12000rmp離心1min；

(6)收集：加入收集液如超純水等，加入后輕輕吹打至DNA單鏈完全懸浮，吸出后用于焦磷酸測序或4℃密封保存。

(7)加樣：通過加樣針41蘸取任一一種dNTP試劑使得所述加樣針41外周附著所述dNTP試劑；

(8)反應：將附著所述dNTP試劑的加樣針41插入測序反應液中，再使所述加樣針41離開所述測序反應液；

(9)結論：生物發光檢測裝置5連接一電腦，拍照并呈現檢測的譜圖。

其中，為實現完成測序，優選為將4種dNTP試劑任一或多個依待測序列而定以何種順序加入測序反應液中，例如：僅檢測單個堿基是否變異時，可根據已知的前后序列先確定待測堿基位置后，依次重復上述步驟4次加樣(加入4種dNTP試劑)，分別加入同一測序反應液中檢測該堿基。

由于親和連接體的直徑大于DNA單鏈分離裝置的濾膜22直徑，因此在DNA單鏈通過濾膜22時，未結合親和連接體的DNA單鏈及其他雜質可以通過濾膜22，而結合親和連接體的單鏈被留在了膜上而無法通過，這種過濾是物理性的。

本實施例中的DNA分離過程中所涉及的溶液、參數及其他分離條件，均為本實施例中的優選實施方案，任何參照現有技術可以起到相應作用的實驗條件、參數及溶液均可用于本發明中所涉及的分離純化過程，本實施例中的具體參數及溶液選擇不應作為對本發明的限制。

本實施例所得測序譜圖及其他實驗結果數據(測序時間、加樣重復精度、均一性)與實施例1所得數據為理論誤差范圍內的一致性，其加樣重復精度為96％。

實施例2

由于收集在濾膜22上的一條鏈需要將其吸出或倒出，這樣的收集方式可能造成一定的收集損失，因此發明人優選地將過濾柱21設置為兩頭調換使用的雙頭結構，濾膜22設于過濾柱21的非端面，需要收集時，將過濾柱21兩頭進行調換后采用常規方式，如離心等，可將濾膜22上的全部DNA單鏈洗脫下來，減少樣品損失。

如圖5所示，本實施例與實施例1的區別僅在于，實施例2中的過濾柱21為上下對稱結構的中空狀圓柱體，濾膜22垂直位于中空柱體中部，該過濾柱21可兩端調換使用，中空柱體的內徑為4.5mm，濾膜22直徑為4.7mm，通過將濾膜22強行壓入過濾柱21中使之緊密貼合不留縫隙，柱體內加設濾膜22限位壓膜機構(圖中未示出)，以固定濾膜22無法進行位移。由于該DNA單鏈分離裝置無論是在結構上還是在功能上兩端均相同，故該DNA單鏈分離裝置無需區分進液端與出液端，在使用時兩端可任意擇一使用。

在經過步驟(4)洗去多余的NaOH之后，調換過濾柱21的兩端，加入收集液，靜止1mins以上，無需吹打即可進行洗脫步驟，洗脫時離心機轉速不超過10000rpm，至少離心2min。收集后可通過nanodrop檢測DNA濃度，進行焦磷酸測序。

本實施例所得測序譜圖及其他實驗結果數據(測序時間、加樣重復精度、均一性)與實施例1所得數據為理論誤差范圍內的一致性，其加樣重復精度為95％。

實施例3

如圖6所示，本實施例與實施例1的區別僅在于，實施例3中DNA單鏈分離裝置的過濾柱21采用空間圓臺型結構，濾膜22設置在兩圓臺型過濾柱21的公共頂面處，圓臺型過濾柱21的頂面直徑與濾膜22的直徑一致，濾膜22兩側設有壓膜機構(圖中未示出)，以固定濾膜22無法進行位移。圓臺形過濾柱的開口下端的側壁上設有凸臺，保證在兩端對調時可固定在收集管23的凸臺上。

使用本實施例中所屬的分離裝置的分離方法與實施例1中所述的步驟相同，與實施例1的區別僅在于：在經過步驟(4)洗去多余的NaOH之后，調換過濾柱21的兩端，加入收集液，靜止1mins以上，無需吹打即可進行洗脫步驟，洗脫時離心機轉速不超過10000rpm，至少離心2min。收集后可通過nanodrop檢測DNA濃度，進行焦磷酸測序。

本實施例所得測序譜圖及其他實驗結果數據(測序時間、加樣重復精度、均一性)與實施例1所得數據為理論誤差范圍內的一致性，其加樣重復精度為95％。

實施例4

如圖7所示，本實施例與實施例1的區別僅在于，為了更好的聚集與引導反應液，使反應液分離更充分更完全，規避過濾死角，該實施例在實施例1的基礎上增設了一分離通道211，所述分離通道211設置在兩過濾柱21之間并與二者連通，兩個過濾柱21與分離通道211共中心軸線，濾膜22設置在分離通道211的對稱面上，濾膜22兩側設有壓膜機構(圖中未示出)，以固定濾膜22無法進行位移，兩個過濾柱21的中部設有凸臺，保證兩端對調時可以固定在收集管23的凸臺上。

過濾柱21與分離通道211相連接的一端為倒圓臺狀，二者共同構成一漏斗狀空間結構，倒圓臺端的底面直徑與過濾柱21內徑一致，頂面直徑與分離通道211的直徑一致，該種結構的設置有利于反應液的聚集與引導，使得反應液分離更充分更完全。因此，該實施例中的DNA單鏈分離裝置在實施例2的基礎上使得DNA單鏈過濾分離更徹底，分離效率顯著提高。

使用本實施例中所屬的分離裝置的分離方法與實施例1中所述的步驟相同，與實施例1的區別僅在于：在經過步驟(4)洗去多余的NaOH之后，調換過濾柱21的兩端，加入收集液，靜止1mins以上，無需吹打即可進行洗脫步驟，洗脫時離心機轉速不超過10000rpm，至少離心2min。收集后可通過nanodrop檢測DNA濃度，進行焦磷酸測序。

本實施例所得測序譜圖及其他實驗結果數據(測序時間、加樣重復精度、均一性)與實施例1所得數據為理論誤差范圍內的一致性，其加樣重復精度為95％。

實施例5

本實施例與實施例4的區別僅在于，濾膜22可垂直于分離通道211置于其中任一位置，兩個過濾柱21為中空的不對稱結構，濾膜22的直徑略大于分離通道211，濾膜22兩側設有壓膜機構(圖中未示出)，以固定濾膜22無法進行位移。

引物設計時，也可選擇生物素-親和素結合的親和連接體標記，任何可以進行DNA標記的連接體均可用于固定在膜上，在此不做贅述。

如使用帶有親和素的親和連接體，則DNA單鏈分離的膜系也可以選擇帶有親和吸附的膜系，用于分離DNA單鏈。具有親和吸附作用的膜系包括硅膜基質膜、磁性顆粒膜、陰離子交換材料膜、硝酸纖維素膜或聚酰胺膜，以及經修飾、包被的磁珠和/或二氧化硅膜等，在此不做限制。

本發明中的雙鏈DNA分離也可采用現有技術中的常規收集方式，例如DNA單鏈分離試劑盒等，只要可以起到DNA單鏈分離收集的結構及方法均應納入本發明的保護范圍之內，在此不做贅述。

本實施例所得測序譜圖及其他實驗結果數據(測序時間、加樣重復精度、均一性)與實施例1所得數據為理論誤差范圍內的一致性，其加樣重復精度為95％。

實施例6

本實施例與實施例1的區別僅在于：所述加樣針41的端面為平面，直徑為1.5mm，表面光潔度為Ra 3.2，且加樣方法中所述步驟a中所述加樣針41離開所述dNTP試劑液時的移動速度為50cm/s，所述步驟b中所述加樣針41離開所述測序反應液時的移動速度為0.4cm/s，在測序反應液內上下運動5次后離開測序反應液。

本實施例所得測序譜圖及其他實驗結果數據(測序時間、加樣重復精度、均一性)與實施例1所得數據為理論誤差范圍內的一致性，其加樣重復精度為96％。

實施例7

本實施例與實施例1的區別僅在于：所述加樣針41的端面為圓錐體，直徑為1.6mm，錐度60度，表面光潔度為Ra 9.8，且加樣方法中所述步驟a中所述加樣針41離開所述dNTP試劑液時的移動速度為5cm/s，所述步驟b中所述加樣針41離開所述測序反應液時的移動速度為4.5cm/s，在測序反應液內上下運動12次后離開測序反應液。

本實施例所得測序譜圖及其他實驗結果數據(測序時間、加樣重復精度、均一性)與實施例1所得數據為理論誤差范圍內的一致性，其加樣重復精度為95％。

最后有必要在此說明的是：以上實施例只用于對本發明的技術方案作進一步詳細地說明，不能理解為對本發明保護范圍的限制，本領域的技術人員根據本發明的上述內容作出的一些非本質的改進和調整均屬于本發明的保護范圍。最后有必要在此說明的是：以上實施例只用于對本發明的技術方案作進一步詳細地說明，不能理解為對本發明保護范圍的限制，本領域的技術人員根據本發明的上述內容作出的一些非本質的改進和調整均屬于本發明的保護范圍。