本發明涉及一個植物花粉發育相關蛋白osbw及其編碼基因與應用。
背景技術：
1、水稻(oryza?sativa?l.)是世界上最重要的糧食作物之一，養活了世界近一半的人口，在糧食作物中占據重要的地位。面對著日益增長的人口壓力和耕地面積減少，水稻產量的提高則顯得尤為重要。三系法雜交稻是經典的方法，不足之處是受恢保關系制約，配組不自由，雜種優勢利用率低；而兩系法則受溫度光照等外界環境影響大。隨著生物技術的快速發展，通過普通隱性雄性核不育系和工程繁殖系組成的第三代雜交水稻種子生產體系為提高糧食產量增添了新的途徑。普通隱性核雄性不育材料在任何環境下都是不育的，敗育徹底，遺傳簡單，是作物雜種優勢利用的理想遺傳工具。第三代雜交水稻不僅克服了三系不育系配組局限和兩系不育系可能因氣候異常導致育性不穩定的缺點，還同時兼備了三系法不育系育性穩定和兩系法不育系配組自由的優點。隱性核雄性不育基因和該基因突變產生的不育系為第三代雜交水稻制種的研發提供了元件和理論基礎，因此，穩定隱性雄性核不育系的創制對雜交水稻的發展具有重要意義。
2、雌雄配子體的發育是植物進行世代交替的基礎。花粉壁結構的破壞經常導致花粉敗育進而造成雄性不育。花粉壁在結構上主要分為花粉包被、外壁和內壁三層結構。由長鏈脂肪酸和苯丙素類衍生物組成的孢粉素是花粉外壁的重要組分。本技術專利涉及的f375突變體的花粉外壁發育異常。突變蛋白osbw屬于strl(strictosidine?synthase-like)家族，目前尚無osbw生物功能的報道。
3、
技術實現思路
1、本發明的目的是提供一個植物花粉發育相關蛋白osbw及其編碼基因與應用。
2、本發明提供的花粉發育相關蛋白(osbw)，來源于稻屬水稻(oryza?sativa?var.寧粳4號)，是如下(a)或(b)的蛋白質：
3、(a)由seq?id?no.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質；
4、(b)將seq?id?no.1的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物花粉發育相關的由seq?id?no.1衍生的蛋白質。
5、seq?id?no.1由480個氨基酸殘基組成，自氨基末端第266至353位為strl結構域。
6、為了使(a)中的osbw便于純化，可在由seq?id?no.1所示的氨基酸序列組成的蛋白質的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標簽。
7、表1標簽的序列
8、 標簽 殘基(氨基酸) 序列 poly-his 2-10(通常為6個) hhhhhh flag 8 dykddddk
9、上述(b)中的osbw可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進行生物表達得到。上述(b)中的osbw的編碼基因可通過將seq?id?no.2所示的dna序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標簽的編碼序列得到。
10、編碼上述植物花粉發育相關蛋白的基因osbw也屬于本發明的保護范圍。
11、所述基因可為如下1)或2)或3)或4)的dna分子：
12、1)seq?id?no.2所示的osbw的cds；
13、2)seq?id?no.3所示的osbw的genomic?dna；
14、3)在嚴格條件下與1)或2)限定的dna序列雜交且編碼所述蛋白的dna分子；
15、4)與1)或2)或3)限定的dna序列具有90％以上同源性，且編碼植物花粉發育相關蛋白的dna分子。
16、seq?id?no.2由1443個核苷酸組成，為基因osbw的cds。
17、含有以上任一所述基因的重組表達載體。
18、可用現有的植物表達載體構建含有所述基因的重組表達載體。
19、所述植物表達載體包括雙元農桿菌載體或可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mrna加工或基因表達的dna片段。所述聚腺苷酸信號可引導聚腺苷酸加入到mrna前體的3’端，如農桿菌冠癭瘤誘導(ti)質粒基因(如胭脂合成酶nos基因)、植物基因(如大豆貯存蛋白基因)3’端轉錄的非翻譯區均具有類似功能。
20、使用所述基因構建重組植物表達載體時，在其轉錄起始核苷酸前可加上任何一種增強型啟動子或組成型啟動子，如花椰菜花葉病毒(camv)35s啟動子、玉米的泛素啟動子(ubiquitin)，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結合使用；此外，使用本發明的基因構建植物表達載體時，還可使用增強子，包括翻譯增強子或轉錄增強子，這些增強子區域可以是atg起始密碼子或鄰接區域起始密碼子等，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區域可以來自轉錄起始區域或結構基因。
21、為了便于對轉基因植物細胞或植物進行鑒定及篩選，可對所用植物表達載體進行加工，如加入可在植物中表達的編碼可產生顏色變化的酶或發光化合物的基因(gus基因、綠色熒光蛋白基因等)、具有抗性的抗生素標記物(慶大霉素標記物、卡那霉素標記物等)或是抗化學試劑標記基因(如抗除草劑基因)等。
22、所述重組表達載體優選為在pcambia1305.1載體的重組位點bamhi上插入所述基因osbw得到的重組質粒，命名為pcambia1305.1-osbw。
23、含有以上任一所述基因(osbw)的表達盒、轉基因細胞系及重組菌。
24、擴增所述基因(osbw)全長或任一片段的引物對也屬于本發明的保護范圍。
25、本發明提供了一種osbw基因的不育突變體序列及其導致雄性不育的突變體材料。具體而言，雄性不育突變體材料是通過對水稻內源的osbw基因進行突變，或對與其高度同源的基因進行核苷酸序列的突變而產生，使植物失去雄性生殖能力。突變的方法包括但不限于物理或化學方法引起的基因突變，其中化學方法包括使用諸如ems等誘變劑進行的誘變。這些突變可以是堿基替換，也可以是dna片段的插入或缺失，還可以通過rnai、crispr等基因工程技術生成。用于創制雄性不育材料的受體，包括目前已知的所有水稻品種。
26、本發明所述基因osbw在調節植物雄配子發育中的應用。
27、抑制本發明所述基因osbw可導致植物雄配子體的發育異常，并影響籽粒的形成。將所述蛋白的編碼基因導入該基因突變所致雄性不育的植物中，可以培育雄配子體正常發育的植物。
28、一種恢復植物雄配子體育性的方法。
29、本發明提供的恢復植物雄配子體育性的方法，是將所述基因osbw導入雄性不育的植物中，得到雄配子體發育正常的轉基因植物；所述雄性不育的植物為花粉壁發育異常，不產生籽粒的植物；所述雄配子體發育正常的轉基因植物為雄配子體發育與正常型相當的轉基因植物。具體來說，所述基因通過所述重組表達載體導入雄性不育的植物中；所述雄性不育的植物的編號為f375。
30、所述蛋白、所述基因、所述重組表達載體、表達盒、轉基因細胞系或重組菌或所述方法均可應用于水稻育種。
31、利用任何一種可以引導外源基因在植物中表達的載體，將編碼所述蛋白的基因導入植物細胞，可獲轉基因細胞系及轉基因植株。攜帶有所述基因的表達載體可通過使用ti質粒、ri質粒、植物病毒載體、直接dna轉化、顯微注射、電導、農桿菌介導等常規生物學方法轉化植物細胞或組織，并將轉化的植物組織培育成植株。被轉化的植物宿主既可以是單子葉植物，也可以是雙子葉植物，如：煙草、百脈根、擬南芥、水稻、小麥、玉米、黃瓜、番茄、楊樹、草坪草、苜宿等。
32、有益效果：
33、本發明首次發現、定位并克隆得到一個新的植物花粉壁發育相關蛋白的基因osbw。本發明的植物花粉壁發育相關蛋白影響植物的雄配子體發育過程。抑制該蛋白編碼基因的表達可導致植物雄配子體的發育異常，并影響籽粒的形成，從而可以培育花粉壁發育異常的轉基因植物和雄性不育的轉基因植物。將所述蛋白的編碼基因導入雄性不育的植物中，可以培育雄配子體正常發育的植物。所述蛋白及其編碼基因可以應用于植物遺傳改良。