本發明涉及分子生物學及環境生物，具體涉及一種檢測氟化物微生物降解相關功能基因表達量的pcr芯片、試劑盒及其應用。
背景技術：
1、含氟化合物已廣泛應用并在環境中大量存在，以全氟化合物(pfcs)為例，全氟化合物是一類人工合成的有機化學物質，是由烷烴分子碳鏈上的氫部分或全部被氟取代而形成的。根據氟化碳鏈上連接的官能團不同，能衍生出數千種pfcs。為人所熟知的pfcs主要包括：全氟辛酸(pfoa)、全氟辛烷磺酸(pfos)、全氟羧酸(pfcas)、全氟磺酸(pfsas)、全氟烷酸(pfaas)、全氟磷酸(pfpas)、全氟丁磺酸(pfbs)、全氟辛基磺酰氟(posf)、全氟丁烷羧酸(pfba)、全氟己烷磺酸(pfhxs)和全氟烷基類(pfas)等。
2、由于氟的電負性最大，所以c－f鍵具有強極性，且c－f鍵是自然界中鍵能最大的共價鍵之一，這使得pfcs具有疏水、疏油性、化學穩定性、表面活性、耐溫性、耐強氧化劑性及低揮發性等眾多特點。由于這些獨特性質，pfcs在化工、涂料、制革、造紙、電鍍、消防設施和紡織等行業得到廣泛應用。如因具備疏油、疏水等特性，被廣泛用于生產紡織品、皮革制品、家具和地毯等表面防污處理劑；化學性質非常穩定，被作為中間體用于生產涂料、泡沫滅火劑、地板上光劑、農藥和滅白蟻藥劑等；廣泛地被使用在合成洗滌劑、義齒洗滌劑、洗發香波及其他表面活性劑產品等日用化學品中，以及大量用于紙張表面處理和器皿生產過程，包括與人們生活接觸密切的紙制食品包裝材料和不粘鍋等近千種產品。就目前而言，有多于5000種全氟化合物在世界市場上市。
3、pfcs的廣泛生產、供應、使用和廢棄物的處置等多個過程，導致其不可避免地進入到水體、空氣、土壤和生物體中。與其他持久性有機污染物疏水的特性不同，pfcs能溶解于水體中且具有高溶解度。加上日常生活中多種產品的生產原料都涉及pfcs，這導致環境水體受到pfcs的嚴重污染。環境水體中的pfcs濃度通常為ng/l和μg/l水平。因為pfcs在自然界穩定中，不易被物理、化學和生物作用所降解。其中，pfos類物質，即全氟辛基磺酸及其鹽類以及全氟辛基磺酰氟，由全氟化酸性硫酸基酸中完全氟化的陰離子組成并以陰離子形式存在于鹽、衍生體和聚合體中。pfos類物質具有持久性、生物累積性、生物毒性、遠距離遷移性等，目前已被重點監管。
4、針對已污染地下水，采用合理的修復技術進行治理尤為重要，常用的修復技術有物理、化學和微生物修復技術。
5、物理去除技術包括氣相抽提和吸附技術，但氟化物并無法通過物理去除技術降解成對環境無害的物質，還需要進一步采取有效方法降解氟化物。化學修復技術主要包括化學氧化和還原，該方法需要施加大量強氧化性物質或高還原能力的物質，是復合污染地區的優選方法，但有二次污染的風險。
6、生物修復技術包括植物修復方法和微生物修復方法，而微生物修復方法是通過微生物自身生長與代謝活動對氟化物進行降解，是應用較廣泛的修復方法，具有綠色、經濟等特點。根據微生物的需養情況主要分為好氧和厭氧兩種方式。
7、目前微生物降解修復技術的研究，不僅局限于反應條件、去除效率、中間產物等宏觀問題，而是需要深入到探索微生物控制有機物降解基因及其調控機制的微觀領域，并進一步分析反應體系中微生物數量和種群結構的動態變化，探索有機物降解和微生物之間的關系，以期更有效的分析微生物生物修復的可行性、監控修復進程、調整修復方案及對比修復成效。而這就需要分子生物學和基因工程等技術手段的輔助。
8、目前常用的微生物群落結構分析技術主要包括16s?rrna測序技術、宏基因組測序技術和實時熒光定量pcr(qpcr)技術。16s?rrna是細菌和古細菌中的一個高度保守的基因片段，同時具有一定的變異性，通過對16s?rrna基因進行測序可以確定微生物群落中存在的不同菌屬和菌種，并評估相對豐度。宏基因組測序技術是對環境樣本中整個微生物群落總dna進行分析，解析微生物功能和環境之間的關系，挖掘和研究特定功能基因及代謝通路，不僅得到微生物群體的多樣性和豐度，還能進行功能基因的聚類和分析。qpcr技術是指利用熒光信號的變化檢測pcr擴增反應中每一個循環擴增產物量的變化，通過內參基因和目標基因的ct值關系對待測模板相應基因進行定性分析。
9、相較于qpcr技術有明確的待測基因，16s?rrna測序技術可能面臨一個因菌屬/菌種在群落中的豐度低而檢測無結果。同時16s?rrna測序技術主要針對群落種類，而對功能基因研究不夠，而宏基因組測序技術主要針對群落dna，對于功能基因的表達無法探知。總rna測序技術可以彌補這一不足，但仍面臨測序技術靈敏度問題。
10、關于qpcr技術，目前主要集中在利用qpcr技術研究污染場地的微生物群落結構(即針對能夠降解該污染物的目標菌種設計引物，然后檢測該目標菌種的數量)，從而評估污染場地中的污染物的微生物降解可能性，但微生物群落結構的檢測方法操作繁瑣，且難以檢出能夠降解該污染物的全部菌種，不可避免的存在著漏檢，以及檢出的菌種還存在相應的還原脫鹵基因是否表達的問題，因此，現有檢測方法無法全面反應氟化物污染和生物降解情況，也無法直接反應該污染場地中的全氟化合物的生物降解可能性。
技術實現思路
1、本發明的目的是為了克服現有技術存在的無法全面反應氟化物污染和生物降解情況，也無法直接反應污染場地中的全氟化合物的微生物降解可能性的問題，提供一種檢測氟化物微生物降解相關功能基因表達量的pcr芯片、試劑盒及其應用，將所述pcr芯片通過qpcr技術能夠精確檢測氟化物微生物降解相關的功能基因的表達情況，在氟化物污染場地生物降解能力評估、降解過程研究和修復效果驗證等方面具有可靠性。
2、為了實現上述目的，本發明一方面提供一種檢測氟化物微生物降解相關功能基因表達量的pcr芯片，所述pcr芯片包括分別用于特異性擴增deha1基因、dehh2基因、hddph基因和alkb基因的引物對，以及特異性擴增內參基因的引物對；
3、其中，用于特異性擴增deha1基因的引物對，其上游引物和下游引物的核苷酸序列分別如seq?id?no.1和seq?id?no.2所示；
4、用于特異性擴增dehh2基因的引物對，其上游引物和下游引物的核苷酸序列分別如seq?id?no.3和seq?id?no.4所示；
5、用于特異性擴增hddph基因的引物對，其上游引物和下游引物的核苷酸序列分別如seq?id?no.5和seq?id?no.6所示；
6、用于特異性擴增alkb基因的引物對，其上游引物和下游引物的核苷酸序列分別如seq?id?no.7和seq?id?no.8所示。
7、優選地，用于特異性擴增內參基因的引物對，其上游引物和下游引物的序列如seqid?no.9和seq?id?no.10所示。
8、優選地，所述pcr芯片還包括芯片板，每對引物對都單獨存在于所述芯片板的檢測孔中。
9、本發明第二方面提供一種試劑盒，所述試劑盒包括如上所述的pcr芯片。
10、本發明第三方面提供了如上所述的pcr芯片或如上所述的試劑盒在用于檢測氟化物微生物降解相關功能基因的表達量中的應用。
11、本發明第四方面提供了如上所述的pcr芯片或如上所述的試劑盒在用于檢測能夠降解氟化物的微生物中的應用。
12、本發明第五方面提供了如上所述的pcr芯片或如上所述的試劑盒在評估氟化物污染場地微生物降解能力中的應用。
13、本發明第六方面提供了如上所述的pcr芯片或如上所述的試劑盒在評估氟化物污染場地的微生物修復可行性中的應用。
14、本發明第七方面提供了一種檢測氟化物微生物降解相關功能基因表達量的方法，該方法包括以下步驟：
15、a1、收集待測樣品中的菌群，提取所述菌群的總rna；
16、a2、以所述總rna為模板進行反轉錄反應，得到cdna；
17、a3、以所述cdna為模板，利用如上所述的pcr芯片，進行qpcr反應，得到功能基因和內參基因的ct值；
18、a4、根據ct值計算功能基因相對于內參基因的相對表達倍數。
19、本發明第八方面提供了一種評估氟化物污染場地的微生物降解能力的方法，該方法包括以下步驟：
20、(1)采集污染場地的水樣，收集水樣或經處理后的水樣中的菌群；
21、(2)提取所述菌群的總rna，并以所述總rna為模板進行反轉錄反應，得到cdna；
22、(3)以所述cdna為模板，利用如上所述的pcr芯片，進行qpcr反應，得到功能基因和內參基因的ct值；
23、(4)根據ct值計算功能基因相對于內參基因的相對表達倍數，通過相對表達倍數評估污染場地中的微生物對氟化物的降解能力。
24、優選地，反轉錄反應的過程包括：將所述總rna、反轉錄反應混合液、gdna去除劑和無rna酶水混合，構成反轉錄反應體系，進行反轉錄反應，得到cdna。
25、優選地，反轉錄反應的條件包括：40～45℃孵育10～20min，80～90℃加熱5～15s。
26、優選地，qpcr反應的條件包括：90～95℃加熱5～10s，隨后在55～65℃反應20～60s，循環40～60次。
27、本發明提供的pcr芯片，能夠用于特異性擴增氟化物生物降解作用相關功能基因(包括脫鹵作用相關的deha1、dehh2、hddph基因，以及與氟化物代謝相關的烷烴單氧酶alkb)，將所述pcr芯片通過qpcr技術，能夠精確檢測氟化物微生物降解相關功能基因的表達情況，探索氟化物污染場地的生物修復可行性，評估氟化物污染場地的生物修復進程，還可進一步輔助指導氟化物污染場地的生物修復方法改進。
28、本發明提供的檢測方法，是利用所述pcr芯片進行的，通過精選靶基因(deha1、dehh2、hddph和alkb基因)，使該檢測方法的特異性好、準確度高、靈敏度高，適用于高通量擴增/篩選，快速且可重現性高；該檢測方法能夠實現對多種環境介質和培養物中氟化物降解相關功能基因的檢測。