本發明屬于分子生物學領域，具體涉及一種基于snp標記的甘松dna指紋圖譜、基因芯片及應用。
背景技術：
1、甘松為敗醬科植物甘松 nardostachys?jatamansidc.的干燥根及根莖，是一種藥材，歷年中國藥典均有收載，其味辛、甘，性溫，具有理氣止痛、開郁醒脾、外用祛濕消腫的功效，對治療脘腹脹滿、嘔吐、食欲不振等癥具有顯著的療效，同時，甘松也是藏香的原料之一。
2、甘松作為一種具有重要生態、藥用、工業、農業和潛在景觀價值的多年生草本植物具有相當大的市場潛力。然而，目前對野生甘松采伐的依賴已不足以滿足可持續需求，導致自然資源不斷枯竭，甘松已被國際自然保護聯盟（iucn）列為極危物種，并被列入《瀕危野生動植物種國際貿易公約》（cites）附錄ii。因此，開發高產優質品種及其兼容的栽培技術已成為該產業可持續發展的重要支柱，同時，品種分子鑒定是行業健康發展的必然要求，制定甘松品種鑒定技術標準是非常必要的。
3、早期研究認為甘松屬植物分為3種，大花甘松（ nardostachys?grandiflora）、甘松（ nardostachys?chinensis）和匙葉甘松（ nardostachys?jatamansi），我國僅分布有甘松和匙葉甘松兩種。目前大多數研究認為它們是同一種植物。目前通過對其植物形態研究發現：甘松種子光滑，葉形呈倒披針形，葉鞘殘基呈片狀，暗棕色或更深；匙葉甘松種子絨毛，葉呈長匙形，葉鞘殘基呈纖維狀，黃褐色或更淺。因此，針對我國甘松屬的種質資源分類及多樣性，從分子層面對甘松屬資源進行分類和評價，對理清甘松種質分類及資源評價有著重要意義。
4、在品種鑒定領域，基于形態學、細胞學或分子標記的分類劃分往往不足以解決物種邊界和近緣類群的分類爭議。snp作為基因組中分布最廣的遺傳標記，具有高密度、高遺傳穩定性和易于自動化分析的特點，使得高效、低成本的snp基因型檢測技術成為共享技術和平臺發展的首選。目前，基因芯片法是snp標記基因分型最常用的方法，包括snp固相芯片和snp液相芯片。高通量snp液相芯片是開展作物高通量基因分型、種質資源鑒定、真假種子鑒定、指紋圖譜構建等分子育種研究的重要工具。snp分子標記鑒別農作物品種已成為新品種保護的重要依據之一。
5、gbs是一種基于限制性內切酶的減少表征基因組測序方法，無需參考基因組即可高效且經濟地發現全基因組snp。這使得gbs?特別適合于缺乏基因組資源的非模式瀕危植物，如甘松。dna指紋識別已被證明在準確區分物種和品種、支持保護工作和促進育種計劃方面是有效的。目前，國內外尚未見有相關技術用于甘松品種鑒定，鑒于此，本發明提供一種通過gbs獲取甘松基因組snp，并基于snp標記構建甘松dna指紋圖譜的方法，為甘松品種管理、質量檢測提供科技支撐，為甘松種質資源分析奠定技術基礎。
技術實現思路
1、本發明基于gbs獲取甘松基因組snp，共鑒定出248個核心snp位點，并通過靶向捕獲測序技術開發snp液相基因芯片，位點均勻覆蓋染色體組，代表性強，多態性高，特異性高，通用性強，適合應用于甘松品種鑒定。本發明的研究成果對甘松種質資源的保護和利用具有重要意義，為甘松的遺傳研究奠定基礎，并有可能指導育種計劃，旨在提高甘松物種的恢復力和適應性。同時，本發明基于snp標記構建甘松dna指紋圖譜，為甘松品種管理、質量檢測提供科技支撐，為甘松種質資源分析奠定技術基礎。
2、在本發明的第一方面，本發明提供一種檢測snp位點的試劑在如下至少一項中的應用：
3、1）在甘松品種鑒定中的應用；
4、2）在制備用于甘松的品種鑒定的基因芯片中的應用；
5、3）在甘松遺傳選育中的應用；
6、4）在甘松指紋圖譜構建中的應用；
7、5）在甘松遺傳多樣性分析中的應用；
8、其特征在于，所述snp位點選自下表所示的定位于參考基因組cnp0006696?和na0504869的snp位點的組合：
9、表1?甘松snp位點組合
10、
11、
12、
13、本發明所述的參考基因組來自中國國家基因庫序列檔案（china?national?genebank?sequence?archive，cnsa，https://db.cngb.org/cnsa），基因登錄號為cnp0006696和na0504869。
14、所述試劑包括但不限于引物和/或探針、snp固相芯片或snp液相芯片。
15、在本發明的具體實施例中，上述snp位點通過如下方法篩選得到：
16、（1）提取甘松樣本的基因組dna，對dna樣品質量進行檢測，用限制性內切酶對dna進行酶切；
17、（2）將步驟（1）得到的酶切片段與測序接頭連接，進行pcr擴增、樣品混池、片段回收，構建得到gbs文庫，對文庫進行質檢，質檢合格后進行測序；
18、（3）將步驟（2）gbs基因組測序所得的高質量clean?data，采用stacks軟件將拼接獲得的clean?reads進行聚類，對snp檢測和篩選，篩選出高質量snp位點用于后續分析；
19、（4）將步驟（3）篩選出的snp位點再分別進行篩選，得到248個核心?snp?位點。
20、步驟（3）中對snp檢測利用cstacks、sstacks、tsv2bam、gstacks程序完成基因組組裝和突變檢測。
21、步驟（3）中所述的篩選使用vcftools軟件對snp分型結果進行篩選，篩選條件如下：（1）缺失率<0.2；（2）maf≥0.01；dp>4。
22、所述步驟（4）中對高質量snp位點再分別進行篩選的標準為maf＞0.1、pic＞0.3。
23、在本發明的第二方面，本發明提供一種甘松snp液相芯片，所述snp液相芯片用于甘松的品種鑒定，其特征在于，所述基因芯片包括snp位點探針組合，所述snp位點探針組合用于鑒別本發明第一方面所述的snp位點的基因型。
24、在本發明的具體實施方式中，所述snp位點探針組合是根據本發明第一方面所述的snp位點合成的單鏈dna。進一步，所述探針的5’端帶有生物素基團，探針通過c12分子臂和氨基修飾偶聯在熒光微球上，每個熒光微球偶聯一種探針。
25、本發明所述的甘松snp液相芯片通過如下方法制備得到：
26、（1）以本發明第一方面所述的snp位點為中心，篩選其左右120bp中gc含量最接近45％的120bp核苷酸序列作為探針；
27、（2）根據步驟（1）篩選得到的120bp核苷酸序列合成5’端帶有生物素基團修飾的單鏈dna，得到snp位點探針；
28、（3）將步驟（2）制備的snp位點探針偶聯到熒光微球上，加入靶向捕獲試劑進行靶向捕獲，得到甘松snp液相芯片。
29、本發明所述的snp位點探針設計原則如下：
30、探針長度120bp、探針gc含量在25-49％之間，平均gc含量約為45％、同源性區域個數≤3，選取區域最大限度地不包含ssr和gap區域；且優先級為：基因區>基因啟動子區（2kb）>基因下游鄰位區（2kb）>基因間隔區，結合染色體均勻分布原則。
31、在本發明的第三方面，本發明提供一種甘松dna指紋圖譜，所述dna指紋圖譜包括本發明第一方面所述的248個snp位點。
32、在本發明的第四方面，本發明提供一種甘松dna指紋圖譜的構建方法，包括如下步驟：
33、（1）提取甘松樣本的基因組dna，對dna樣品質量進行檢測，用限制性內切酶對dna進行酶切；
34、（2）將步驟（1）得到的酶切片段與測序接頭連接，進行pcr擴增、樣品混池、片段回收，構建得到gbs文庫，對文庫進行質檢，質檢合格后進行測序；
35、（3）將步驟（2）gbs基因組測序所得的高質量clean?data，采用stacks軟件將拼接獲得的clean?reads進行聚類，對snp利用cstacks、sstacks、tsv2bam、gstacks程序完成基因組構建和突變檢測，再使用vcftools軟件對snp分型結果進行篩選，篩選條件為缺失率<0.2；maf≥0.01；dp>4，篩選得到高質量snp位點用于后續分析；
36、（4）將步驟（3）篩選出的snp位點再分別進行篩選，篩選標準為maf＞0.1，pic＞0.3，得到248個核心snp位點，甘松dna指紋圖譜構建成功。
37、在本發明的第五方面，本發明提供一種甘松品種鑒定方法，包括如下步驟：
38、（1）提取待檢甘松樣本的基因組dna，對dna樣品質量進行檢測，用限制性內切酶對dna進行酶切；
39、（2）將步驟（1）得到的酶切片段與測序接頭連接，進行pcr擴增、樣品混池、片段回收，構建得到gbs文庫，對文庫進行質檢；
40、（3）使步驟（2）所述的質檢合格的gbs文庫與本發明第二方面所述的甘松snp液相芯片進行探針雜交反應；
41、（4）對捕獲的序列測序后的基因型分型信息進行提取，形成基因型分型文件；
42、（5）將待檢樣品的基因分型文件與甘松dna指紋圖譜進行比較，判斷待測樣品為甘松（ n.?chinensis）或者匙葉甘松（ n.?jatamansi）。
43、具體的，本發明提供的甘松dna指紋圖譜具有兩種特征：（1）以gjf、?gjl1、?gjl2、qhn1、?qhn2、?qhn3、?qzc1、?qzc2、?sab1、?sab2、sar1?和?sar2生態種群作為一個整體呈現出來的snp位點特征，將其命名為甘松（ n.?chinensis）形snp位點特征；（2）以smp、?smt1、smt2、?smt3、?xdk、?xdy、?ydx、ykd?和?yng生態種群作為一個整體呈現出來的snp位點特征，將其命名為匙葉甘松（ n.?jatamansi）形snp位點特征。
44、判斷標準：若待測樣本的基因型模式與甘松（ n.?chinensis）形snp位點特征相似性>88.00％時，則該樣本屬于甘松（ n.?chinensis）；若待測樣本的基因型模式與指紋圖譜中的匙葉甘松（ n.?jatamansi）形snp位點特征相似性>88.00％時，則該樣本屬于匙葉甘松（ n.?jatamansi）。
45、本發明提供的技術方案具有如下有益貢獻：
46、甘松作為一種具有重要藥用、工業、生態和園林應用價值的瀕危植物，對其物種多樣性的調查、分類和評估至關重要。選擇適合甘松群體鑒定的核心snp標記是構建甘松dna指紋圖譜的關鍵，標記篩選標準因群體大小和基因型的不同而不同，篩選得到的核心snp標記數量也不同。本發明根據21個甘松種群中snp位點設定篩選標準，?最終篩選獲得248個核心snp位點構成標記集，建立種特異性指紋圖譜。所述核心snp標記集具有較強的代表性和鑒別能力，為推動snp分子標記在甘松種質資源精準高效鑒定中的應用提供科學依據。