本披露涉及用于對共配制在單一組合物中的兩種或更多種抗原結合蛋白（例如，抗體）進行檢測和定量的方法。
背景技術：
1、使用具有互補藥理學作用的兩種或更多種分子的組合療法已經促使人們對共配制產品的開發產生了日益濃厚的興趣。共配制品或固定劑量組合藥物（fdc）是其中將兩種或更多種單獨的藥物組分（例如，小分子和生物制劑、或兩種不同的生物制劑（如治療性抗體））組合在單一劑型中的治療劑。這些產品通常可以減少注射的次數和體積、改善患者依從性以及減輕不適。
2、由于共配制的治療劑被分類為新分子實體（nme），因此它們要接受監管機構（如美國食品藥品監督管理局（fda））的臨床評估。因此，另外進行共配制的現有治療劑可能要接受進一步的分析和評估，即使已經通過獨立的臨床試驗確立了每種單獨的治療劑的功效和安全性。
3、對于共配制的生物制劑，還存在要解決的許多化學、制造和控制問題。這些問題包括對共配制品中各種分子進行表征的分析挑戰、配制較高濃度生物制劑的制造問題、以及穩定性問題（如蛋白質-蛋白質相互作用、蛋白質聚集和亞可見顆粒配制品）。
4、仍然需要用于監測共配制的生物分子（例如，高分子量物質）的關鍵質量屬性以及準確地確定藥物制劑或樣品中每種生物制劑的濃度的方法。
技術實現思路
1、本披露提供了確定組合物中第一蛋白質和不同于該第一蛋白質的第二蛋白質各自的濃度的方法，該方法包括：提供包含第一蛋白質和第二蛋白質的所述組合物，其中該第一蛋白質具有第一消光系數，并且該第二蛋白質具有第二消光系數；通過陽離子交換色譜（cex）將所述組合物中的該第一蛋白質與該第二蛋白質分離，由此獲得所述組合物中該第一蛋白質與該第二蛋白質的比率；在一定路徑長度下測量該組合物的總吸光度；以及基于該總吸光度與所述路徑長度和所述消光系數的比率，按該比率進行分配，計算所述第一蛋白質和所述第二蛋白質的濃度。
2、在該方法的一些方面，計算第二蛋白質的濃度包括等式1：
3、
4、其中c2是第二蛋白質的濃度，a總是總吸光度，ε1是第一蛋白質的消光系數，ε2是第二蛋白質的消光系數，b是路徑長度，并且k是組合物中第一蛋白質與第二蛋白質的比率。在該方法的一些方面，計算所述第一蛋白質的濃度進一步包括等式2：
5、，
6、其中c1是第一蛋白質的濃度，c2是第二蛋白質的濃度，并且k是組合物中第一蛋白質與第二蛋白質的比率。
7、在該方法的一些方面，第一蛋白質與第二蛋白質的比率是1?:?1至1?:?100，例如像1?:?1至1?:?80、1?:?1至1?:?40、1?:?1至1?:?20、1?:?1.1至1?:?100、1?:?1.1至1?:?80、1?:?1.1至1?:?40、1?:?1.1至1?:?20、1?:?2至1?:?100、1?:?2至1?:?80、1?:?2至1?:?40或1:?2至1?:?20。
8、在該方法的一些方面，第一蛋白質的等電點（pi）與第二蛋白質的等電點差異至少0.2。
9、在一些方面，該方法進一步包括通過cex、疏水相互作用色譜（hic）或反相高效液相色譜（rp-hplc）將組合物中的第一蛋白質與第二蛋白質分離，以及基于每種蛋白質的校準曲線確定該第一蛋白質和該第二蛋白質的濃度。
10、本披露還提供了分析包含第一蛋白質和不同于該第一蛋白質的第二蛋白質的組合物的色譜方法，該方法包括：提供包含第一蛋白質和第二蛋白質的所述組合物；以及以下中的至少一個：a)?通過尺寸排阻超高效液相色譜（se-uhplc）確定組合物中第一蛋白質和/或第二蛋白質的高分子量（hmw）物質的水平，其中該se-uhplc用包含約100-200?mm?kcl、約1%-5%異丙醇（ipa）和約40-60?mm?k3po4的緩沖液進行；或b)?通過ph梯度陽離子交換高效液相色譜（cex-hplc）分離組合物中第一蛋白質和/或第二蛋白質的電荷變體，其中該cex-hplc包含ph?5-6的第一流動相和ph?10-11的第二流動相。
11、在色譜方法的一些方面，hmw物質包含二聚體、三聚體、四聚體、五聚體、六聚體、七聚體和八聚體中的一種或多種。
12、在色譜方法的一些方面，se-uhplc用包含約150?mm?kcl、約2%?ipa和約50?mmk3po4的緩沖液進行。
13、在色譜方法的一些方面，se-uhplc包含流速為約0.2-0.5?ml/min的流動相。例如，流動相的流速可以為約0.4?ml/min。
14、在色譜方法的一些方面，cex-hplc包含ph為約5.6（如ph?5.6）的第一流動相。在色譜方法的一些方面，cex-hplc包含ph為5.4-5.8的第一流動相。
15、在色譜方法的一些方面，cex-hplc包含ph為約10.2（如ph?10.2）的第二流動相。在色譜方法的一些方面，cex-hplc包含ph為10.0-10.4的第二流動相。
16、在色譜方法的一些方面，cex-hplc包含在至少40、50、60或70分鐘內從100%第一流動相+?0%第二流動相至不超過20%第一流動相+至少80%第二流動相的梯度。
17、在色譜方法的一些方面，cex-hplc包含至少50?mm、75?mm或100?mm的柱。任選地，cex-hplc柱可以包含平均直徑為約3?μm至約7?μm（如約5?μm）的親水多孔聚合物珠的基質。cex-hplc柱可以包括磺丙基離子交換劑化學物質。
18、在一些方面，色譜方法進一步包括在通過cex-hplc分離所述電荷變體后，基于每種蛋白質的校準曲線確定組合物中第一蛋白質和第二蛋白質的濃度。
19、本披露進一步提供了確定組合物中第一蛋白質和第二蛋白質各自的濃度的毛細管電泳方法，其中該第一蛋白質不同于該第一蛋白質，該方法包括：通過毛細管電泳十二烷基硫酸鈉（ce-sds）分析包含第一蛋白質和第二蛋白質的組合物，其中該ce-sds包含該第一蛋白質的第一峰、該第二蛋白質的第二峰、以及該第一蛋白質和該第二蛋白質的共遷移峰；以及基于該第一峰與該第二峰的比率確定該第一蛋白質和該第二蛋白質各自的濃度。
20、在毛細管電泳方法的一些方面，ce-sds是還原型的（rce-sds）或非還原型的（nrce-sds）。
21、在上述方法的一些方面，第一蛋白質和第二蛋白質各自是抗原結合蛋白。
22、在上述方法的一些方面，抗原結合蛋白是抗體、抗體片段或雙特異性t細胞接合劑（bite?）分子。
23、在上述方法的一些方面，第一蛋白質和第二蛋白質各自是治療性抗體。
24、在上述方法的一些方面，治療性抗體與tigit、cd112r、pd-1或vegf特異性結合。
25、在上述方法的一些方面，第一蛋白質是與cd112r特異性結合的抗體，并且第二蛋白質是與tigit特異性結合的抗體。
26、在上述方法的一些方面，第一蛋白質是與pd-1特異性結合的抗體，并且第二蛋白質是與vegf特異性結合的抗體。