本發明屬于腫瘤治療和分子免疫學，涉及一種抗pd-l1和hhla2雙特異性抗體及其制備方法和應用。
背景技術：
1、迄今為止，與傳統的抗癌治療策略相比，免疫治療被認為是最有前景的全身性腫瘤治療方法，在腫瘤微環境中免疫檢查點分子往往被高表達，然后通過抑制t細胞活化以及誘導t細胞耗竭，促使腫瘤逃避免疫系統的攻擊。免疫檢查點抑制是當前抗腫瘤免疫治療中療效最好，走在最前沿的治療手段之一。其中，單克隆抗體因其特異性靶向靶標分子的能力，已成為腫瘤治療中一種關鍵而有效的治療手段。比如抗pd-l、pd-ll和ctla-4等免疫檢查點抑制劑已經在臨床上顯示出了強大的抗腫瘤活性。
2、人內源性逆轉錄病毒h長末端重復序列相關蛋白2(human?endogenous?retrovirus-h?long?terminalrepeat-associating?2，hhla2)，又稱b7-h7或b7y，為新發現的b7家族分子，目前已被鑒定出的b7家族有10個成員：cd80(b7-1)、cd86(b7-2)、b7-h1(pd-l1、cd274)、b7-dc(cd273或pd-l2)、b7-h2(cd275)、b7-h3(cd276)、b7-h4(b7s1、b7x或vtcn1)、b7-h5(vista、gi24或pd-1h)、b7-h6(ncr3lg1)和hhla2(b7-h7或b7y)。
3、hhla2主要分布并高表達在多種腫瘤組織中，僅少量表達于腸道、腎臟、膽囊和乳腺的上皮細胞及胎盤滋養層組織的上皮細胞。hhla2與胰腺癌、肺癌、乳腺癌、骨肉瘤、結直腸癌、腎癌等多種腫瘤的生長、轉移、病理分級和預后等密切相關。一方面，hhla2可以通過與tmigd2的相互作用，在tcr介導的激活背景下共刺激t細胞，通過akt依賴性信號級聯增強t細胞增殖和細胞因子產生；另一方面，hhla2可以通過與t/nk免疫細胞上的kir3dl3作用募集shp-1和shp-2來減弱下游vav1、erk1/2、akt和nf-κb信號，從而顯示出免疫抑制活性。已有的臨床前研究證明hhla2可以促進腫瘤的免疫逃逸，而阻斷hhla2/kir3dl3通路的藥物(尤其是抗體藥)可以遏制腫瘤發展和轉移，因此靶向hhla2/kir3dl3的抗腫瘤治療目前備受關注。
4、然而，由于腫瘤復雜的疾病發病機制，針對單一靶點的單克隆抗體往往難以表現出足夠的治療效果。因此，同時針對兩個靶點的雙特異性抗體(bispecific?monoclonalantibody，bsab)應運而生，雙特異性抗體是一種人工合成的抗體，具有兩個特異性抗原結合位點，這種抗體可以同時結合并識別兩個不同的抗原，或者一個抗原的兩個不同表位。這使得雙特異性抗體具備了聯合療法所不具有的生物學活性，從而展示了巨大的治療潛力，因而在生物醫藥研究中具有廣泛的應用價值，例如在腫瘤治療中可以同時靶向腫瘤細胞和免疫細胞，雙功能調節劑同時結合兩種不同的免疫共刺激或共抑制分子，誘導靶細胞的功能改變，以增強治療效果。大多數雙功能調節劑靶向pd-1/pd-l1和其他免疫抑制分子，如ctla-4(cd152)、tim-3、lag-3或tigit。鑒于雙特異性抗體的多功能性和介導全新moas的潛力，雙特異性抗體領域有望看到更多新興的方法和候選藥物進入臨床，有望在未來幾年提供腫瘤學和非腫瘤學適應癥的關鍵數據，包括在感染、病毒學、自身免疫、代謝、神經病學和眼科中的應用。
5、目前，已見公開報道的作用于hhla2/kir3dl3信號通路的抗體(如cn114729052a、cn112153977a、wo2023138579a1和us20210198366a1等)，已經進入臨床階段研究的有nextpoint及和鉑醫藥的抗hhla2單抗，尚未見抗pd-l1和hlla2的雙特異性抗體及其藥物偶聯物(adc)等抗體衍生物的報道，因此，開發新型針對hhla2/kir3dl3信號通路的抗體，為腫瘤治療提供新手段、新思路，對于腫瘤治療領域具有重要意義。
技術實現思路
1、針對現有技術的不足和實際需求，本發明提供一種抗pd-l1和hhla2雙特異性抗體及其制備方法和應用，開發新型針對hhla2/kir3dl3信號通路的抗體，為腫瘤治療提供新手段、新思路。
2、為達此目的，本發明采用以下技術方案：
3、第一方面，本發明提供一種抗pd-l1和hhla2雙特異性抗體，所述雙特異性抗體包括pd-l1結合域和hhla2結合域，所述pd-l1結合域包括抗pd-l1單克隆抗體可變區，所述hhla2結合域包括抗hhla2納米抗體的可變區；所述抗hhla2納米抗體的可變區通過柔性接頭與所述抗pd-l1單克隆抗體的重鏈n端或重鏈c端連接，或者，所述抗hhla2納米抗體的可變區通過柔性接頭與所述抗pd-l1單克隆抗體的輕鏈的n端或輕鏈的c端連接；所述抗pd-l1單克隆抗體的重鏈可變區cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分別包括seq?id?no.1～seq?idno.3所示的序列，輕鏈可變區cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分別包括seq?id?no.4～seqid?no.6所示的序列；所述抗hhla2納米抗體的可變區的cdr1、cdr2和cdr3的氨基酸序列分別包括seq?id?no.8～seq?id?no.10所示序列。
4、本發明中，設計特定結構的抗pd-l1和hhla2雙特異性抗體，具備高特異性和親和力，能夠同時高效結合pd-l1和hhla2抗原，能夠增強t細胞及nk細胞功能，上調細胞介導的免疫應答，可應用于治療t細胞及nk細胞功能障礙的病癥，包括腫瘤及感染性疾病等。
5、可以理解，本發明中上述所列cdr的氨基酸序列均是按照基于序列可變性的kabat編號系統來表示(kabat?e?a.sequences?of?proteins?of?immunological?interest[m].usdepartment?of?health?and?human?services,public?health?service,nationalinstitutes?of?health,1991)。本領域技術人員熟知，在本領域中可以通過多種編號系統來表示抗體的cdr(例如imgt、chothia、honegger、abm和contact等)。雖然本發明中請求保護的cdr序列范圍是基于kabat編號系統所表示的序列，但是根據其它cdr的編號方案所定義的氨基酸序列也應當落在本發明的保護范圍中。
6、優選地，所述柔性接頭的氨基酸序列包括seq?id?no.7所示序列。
7、優選地，所述抗pd-l1單克隆抗體的重鏈可變區的氨基酸序列包括seq?id?no.11所示的序列，輕鏈可變區的氨基酸序列包括seq?id?no.14所示的序列。
8、優選地，所述抗hhla2納米抗體的可變區的氨基酸序列包括seq?id?no.16所示的序列。
9、優選地，所述雙特異性抗體的非cdr區包括非鼠類物種抗體非cdr區，優選為人抗體非cdr區。
10、優選地，所述抗pd-l1單克隆抗體的重鏈型別為igg1、igg2、igg3或igg4中至少一種。
11、優選地，所述抗pd-l1單克隆抗體的輕鏈型別可為κ鏈或λ鏈。
12、優選地，所述抗pd-l1單克隆抗體的重鏈恒定區的氨基酸序列包括seq?id?no.12或seq?id?no.13所示序列，輕鏈恒定區的氨基酸序列包括seq?id?no.15所示序列。
13、優選地，所述雙特異性抗體的重鏈的氨基酸序列包括seq?id?no.17、seq?idno.18、seq?id?no.19或seq?id?no.20所示的序列，輕鏈的氨基酸序列包括seq?id?no.21所示的序列。
14、優選地，所述雙特異性抗體的重鏈的氨基酸序列包括seq?id?no.24或seq?idno.25所示的序列，輕鏈的氨基酸序列包括seq?id?no.22所示的序列；或者，所述雙特異性抗體的重鏈的氨基酸序列包括seq?idno.24或seq?id?no.25所示的序列，輕鏈的氨基酸序列包括seq?id?no.23所示的序列。
15、優選地，所述雙特異性抗體的緩沖液包括組氨酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、乙酸鹽緩沖液、琥珀酸鹽緩沖液或氨丁三醇緩沖液中的至少一種。
16、優選地，所述緩沖液包括添加氯化鈉和精氨酸的磷酸鹽緩沖液；優選為添加10～150mm氯化鈉的5～50mm磷酸鹽緩沖液，ph為5.5～6.5。進一步優選地，所述緩沖液包括添加氯化鈉和精氨酸的磷酸鹽緩沖液，進一步優選為添加10～150mm氯化鈉和5～20mm精氨酸的5～50mm磷酸鹽緩沖液，ph為5.5～6.5。
17、上述數值范圍表示可在該范圍內任選，例如10～150mm可以是11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、105、110、115、120、125、130、135、140、145、146、147、148或149mm等，5～50mm可以是6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、46、47、48或49mm等，5.5～6.5可以是5.6、5.7、5.8、5.9、6.0、6.1、6.2、6.3或6.4等，5～20mm可以是6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18或19mm等。
18、本發明中，針對雙特異性抗體，設計特定組成的緩沖液，進一步提高雙特異性抗體以及后續利用其制備藥物偶聯物制劑的溶解度，能夠制備高濃度的試劑，進一步利于推廣應用。
19、第二方面，本發明提供一種核酸分子，所述核酸分子編碼第一方面所述的抗pd-l1和hhla2雙特異性抗體。
20、第三方面，本發明提供一種重組載體，所述重組載體含有第二方面所述的核酸分子。
21、第四方面，本發明提供一種重組細胞，所述重組細胞含有第二方面所述的核酸分子。
22、第五方面，本發明提供第一方面所述的抗pd-l1和hhla2雙特異性抗體的制備方法，所述制備方法包括：
23、將第二方面所述的核酸插入表達載體，得到重組載體，將所述重組載體導入宿主細胞，培養宿主細胞，分離、純化得到雙特異性抗體。
24、優選地，所述宿主細胞包括哺乳動物細胞，所述哺乳動物細胞包括cho、hek293、nso或per?6中任意一種。
25、優選地，所述分離、純化的方法包括親和層析和超濾濃縮。
26、優選地，所述超濾濃縮中使用的緩沖液包括組氨酸鹽緩沖液、磷酸鹽緩沖液、檸檬酸鹽緩沖液、乙酸鹽緩沖液、琥珀酸鹽緩沖液或氨丁三醇緩沖液中的至少一種。
27、優選地，所述緩沖液包括添加氯化鈉的磷酸鹽緩沖液；優選為添加50mm氯化鈉的10mm磷酸鹽緩沖液，ph為6.0。
28、優選地，所述緩沖液包括添加氯化鈉和精氨酸的磷酸鹽緩沖液；優選為添加50mm氯化鈉和10mmarg的10mm磷酸鹽緩沖液，ph為6.0
29、本發中設計特定的緩沖液，能夠進一步提高雙特異性抗體的溶解度，制備高濃度的雙特異性抗體。
30、第六方面，本發明提供一種雙特異性抗體偶聯物，所述雙特異性抗體偶聯物包括第一方面所述的抗pd-l1和hhla2雙特異性抗體及與其偶聯的偶聯物。
31、優選地，所述偶聯物包括可檢測標記或藥物。
32、優選地，所述可檢測標記包括放射性同位素、發光物質、有色物質或酶中至少一種。
33、優選地，所述偶聯物包括fitc、pe、apc、cy-5、cy-7、rf488、alexa?fluor?488、percp-cy5.5、apc-cy7、美登素衍生物(dm1、dm4或auristatin(mmae/mmaf)等)、卡列卡霉素、多卡霉素衍生物、pbd或喜樹堿衍生物(sn38或dxd等)、131i、90y、177lu、188re、堿性磷酸酶、辣根過氧化物酶或生物素等中至少一種。
34、第七方面，本發明提供一種試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括第一方面所述的抗pd-l1和hhla2雙特異性抗體或第六方面所述的雙特異性抗體偶聯物。
35、優選地，所述試劑盒還包括第二抗體，其特異性識別所述雙特異性抗體。
36、優選地，所述第二抗體還包括可檢測標記，所述可檢測標記包括放射性同位素、發光物質、有色物質或酶中至少一種。
37、第八方面，本發明提供第一方面所述的抗pd-l1和hhla2雙特異性抗體或第六方面所述的雙特異性抗體偶聯物在制備靶向腫瘤的試劑中的應用。
38、優選地，所述靶向腫瘤的試劑包括預防或治療腫瘤的藥物或腫瘤抗原檢測試劑。
39、優選地，所述腫瘤抗原包括pd-l1和/或hhla2。
40、優選地，所述腫瘤包括表達pd-l1和/或hhla2的腫瘤，例如可包括非小細胞性肺癌，卵巢癌，黑色素瘤、腎腫瘤、前列腺癌、膀胱癌、結腸直腸癌、胃腸道癌或肝癌等中至少一種。
41、第九方面，本發明提供一種藥物組合物，所述藥物組合物包括第一方面所述的抗pd-l1和hhla2雙特異性抗體和/或第六方面所述的雙特異性抗體偶聯物。
42、優選地，所述藥物組合物還包括藥學上可接受的輔料。
43、與現有技術相比，本發明至少具有以下有益效果：
44、本發明構建特定結構抗hhla2和pd-l1雙特異性抗體，所述雙特異性抗體針對hhla2和pd-l1抗原均具備高特異性和親和力，具備nk細胞依賴的腫瘤細胞殺傷能力，能夠上調細胞介導的免疫應答，在mixed?lymplocyte?response中激活人體外周血液中t細胞功能，具備高效的體內抗腫瘤效果，此外，可進一步開發雙特異性抗體藥物偶聯物，具備高效的腫瘤細胞殺傷能力，為治療腫瘤及感染性疾病提供新方法、新思路。