本發明屬于生物工程，尤其是涉及酰胺水解酶突變體及其在制備手性γ-氨基酸類藥物中間體中的應用。具體而言，本技術涉及一種酰胺水解酶突變體，編碼所述酰胺水解酶突變體的核酸，含有所述核酸的重組表達載體，含有所述重組表達載體的重組表達轉化體，突變體催化劑的制備，以及酰胺水解酶突變體或突變體催化劑在制備手性γ-氨基酸類藥物中間體中的應用。
背景技術：
1、( s)-普瑞巴林（結構如式1所示）是一種γ-氨基酸類藥物，主要用于治療癲癇、神經性疼痛、纖維肌痛、廣泛性焦慮癥等疾病。該藥物由輝瑞團隊在20世紀90年代通過結構優化研發而成，優化思路是將加巴噴丁的環己烷環替換為異戊烯基，最終于2004年獲批上市。作為第二代手性抗癲癇藥物，其化學名為( s)-3-氨甲基-5-甲基己酸，藥理活性譜與第一代抗癲癇藥物加巴噴丁相似，但活性強度可達后者的3~10倍。臨床研究證明，相較于( r)-普瑞巴林，( s)-普瑞巴林僅具有更高的安全性，還能提供更優異的臨床療效，具有更顯著的癲癇和神經性疼痛癥狀緩解效果，以及更持久的藥效持續時間。目前( s)-普瑞巴林憑借其更好的臨床療效，已成為世界上最暢銷的藥物之一。
2、（式1）
3、( s)-普瑞巴林合成路線較多，主要可分為三類：
4、(1)?化學拆分法：
5、化學拆分法是先合成外消旋的中間體或產物，再利用手性拆分試劑，拆分后得到手性的化合物。例如：美國warner-lambert公司于1997年在專利us5637767中公布了一種化學拆分方法，最先采用異戊醛和丙二酸二乙酯為原料反應，得到2-羧乙基-5-甲基-己-2-烯酸乙酯，再與氰化鉀反應，先后再經過脫羧、水解、催化加氫等反應，得到消旋體普瑞巴林，最后采用( s)-扁桃體酸進行手性拆分，得到普瑞巴林（化學拆分法的反應路線如式2所示）。該路線的總收率為10.7%，其中手性( s)-扁桃體酸拆分的收率只有27.5%左右，收率很低，拆分后的另一半手性異構體不能回收重新利用。其他公司相關專利包括wo2010061403，cn104496832，cn105348125，wo2008062460，us6046353。
6、（式2）
7、另外，該美國warner-lambert公司還在專利us5616793中，采用異戊醛和氰基乙酸酯為原料反應，得到5-甲基-2-氰基-己-2-烯酸酯，再與丙二酸酯反應，先后經酸化脫羧、脫水得到3-異丁基戊二酸酐（如式3），胺化反應得到3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸，采用手性苯乙胺進行手性拆分，最后通過hoffman降解得到產物普瑞巴林。該路線的總收率為14.5%，其中手性苯乙胺拆分的收率只有37.5%，收率較低，拆分后的另一半手性異構體可以實現回收再生。其他公司相關專利包括：cn104140375,?cn104496832,?cn105481708,wo2011077463,?wo2012093411,?wo9638405。
8、（式3）
9、teva公司在專利wo2007143152中，報道了以2-烷氧羰基-3-氰基-5-甲基己酸酯為原料，先后經過脫羧、水解得到消旋體的3-氰基-5-甲基己酸，通過手性拆分得到( s)-3-氰基-5-甲基己酸，最后催化氫化得到產物普瑞巴林。
10、(2)?酶拆分法：
11、美國輝瑞公司在專利us2007196905中，以異戊醛和氰乙酸乙酯為原料，縮合產物與氰化鉀反應得到2-異丁基丁二腈，在腈水解酶催化條件下水解得到( s)-5-甲基-3-氰基己酸，另外一半手性異構體( r)-2-異丁基丁二腈回收，經過堿處理轉變成消旋的2-異丁基丁二腈再利用，最后( s)-5-甲基-3-氰基己酸催化氫化得到產物普瑞巴林（反應路線如式4所示）。該路線中腈水解酶催化過程中收率在34-43%，浙江工業大學在專利cn112359036a中使用腈水解酶催化過程中收率提升至45.98%。此外經酶催化后的另一半手性異構體( r)-2-異丁基丁二腈經堿處理后的回收率可達到84%。其他公司相關專利包括：us2015344919，cn105463037。
12、（式4）
13、此外，輝瑞公司采用脂肪酶拆分氰基雙酯化合物得到( s)-氰基雙酯化合物，另外( r)-氰基雙酯化合物堿處理得到消旋體回收再利用。該路線的總收率為40-45%，ee值99.75%，純度可達?99.5%。相關論文和專利包括：organic?process?research?&development,?2008,?12(3):?392～398，us2005283023。
14、teva公司在專利wo2009158343中，以3-異丁基戊二酸或3-異丁基戊二酸二酯為原料，在酯化酶或水解酶的作用下得到( s)-3-異丁基戊二酸單酯，再先后通過胺化反應和hoffman降解得到產物普瑞巴林（反應路線如式5所示）。其中水解酶的收率最高可達96%，ee值為95.5%。
15、（式5）
16、(3)微生物酶法：中國科學院微生物所在中國專利cn114164198a公開了將來源于嗜熱脂肪芽孢桿菌( bacillu?sstearothermophilus?sd-1)的d-海因酶進行定向改造獲得突變體，將其作用于3-異丁基戊二酰亞胺使其水解，產生( r)-3-異丁基戊二酸單酰胺的反應（反應路線如式6所示）。其中突變體m63al65hc317t制得產物的手性純度能達到97.5%。專利cn114686465a中公開了熒光假單胞菌( pseudomonas?fluorescens)來源的水解酶表現出優異的( r)-3-異丁基戊二酸單酰胺產物選擇性，并對其進行基因工程化改造，獲得改造后序列1的水解酶，其在底物濃度為100?g/l時，反應36?h，可以達到94.3%的轉化率和95.4%的ee值。
17、（式6）
18、雖然目前已有諸多生物催化劑被用于催化包括3-異丁基戊二酰亞胺在內的底物的不對稱水解反應，但是限于它們不對稱水解活性較低、熱穩定性較差、立體偏好性相反、底物上載量較低等問題，目前仍無法滿足工業生產的需求。本發明目標是篩選改造獲得高活力性、高選擇性、高穩定性高和高蛋白表達的酰胺水解酶，不對稱催化水解3-異丁基戊二酰亞胺得到( s)-普瑞巴林的關鍵手性中間體( r)-3-異丁基戊二酸單酰胺。
技術實現思路
1、本發明針對酰胺水解酶活力低、穩定性不足、底物上載量低等瓶頸問題，提供了一種酰胺水解酶突變體，其具有更高的催化活性、穩定性和蛋白表達水平，可用于制備手性γ-氨基酸類藥物中間體，尤其是合成( s)-普瑞巴林的手性中間體( r)-3-異丁基戊二酸單酰胺。
2、本發明以氨基酸序列如seq?id?no.?1所示的野生型 gshasewt作為出發酶，通過蛋白質工程的手段對其進行進一步的分子改造，獲得多個催化活性、穩定性均顯著提升的酰胺水解酶突變體，提供酰胺水解酶突變體，編碼所述酰胺水解酶突變體的核酸，含有該核酸的重組表達載體，含有該表達載體的重組表達轉化體，重組酰胺水解酶突變體催化劑，以及所述酰胺水解酶突變體或重組酰胺水解酶突變體催化劑在制備手性γ氨基酸類藥物中間體中的應用。
3、其中，野生型 gshasewt來源于嗜熱芽孢桿菌（ geobacillus?kaustophilus?hta426）。
4、本發明通過對酰胺水解酶的氨基酸位點進行組合突變，成功構建并獲得突變體gshasem30。該突變體的核心優勢在于同步實現了高催化活力與對映體選擇性的雙重性能提升，為其工業化應用奠定關鍵基礎。在實際催化性能驗證中，以高密度發酵制備的5g/l凍干細胞作為催化劑，對150g/l底物3-異丁基戊二酰亞胺進行酶解反應：結果顯示，反應可在24h內高效完成，且產物光學純度極高，ee值大于99.80%，同時保持穩定的催化轉化效率。相較于寧波酶賽生物工程有限公司在專利cn114686465a公開的“一種水解酶和一種( r)-(-)-3-(氨甲酰甲基)-5-甲基己酸的合成方法”技術路線（其轉化率最高為94.3%、產物ee值最高為95.4%），本發明的gshasem30在催化轉化效率與產物光學選擇性兩方面均實現顯著突破，能夠充分匹配當前工業化生產對酶催化劑“高效、高選擇性、穩定可控”的核心需求，具備明確的產業化應用潛力。
5、本發明的目的可以通過以下技術方案來實現：
6、技術方案之一，本發明提供系列酰胺水解酶突變體。
7、本發明提供的酰胺水解酶突變體，是將seq?id?no.?1所示的氨基酸序列中的第38位gly、第40位ala、第63位met、第65位phe、第66位gly、第67位gly、第94位leu、第108位trp、第152位phe、第155位tyr、第158位val、第159位phe、第287位trp、第288位ser、第317位cys、第333位thr、第337位asn、第?338位gly、第339位gly、第341位ile、第432位cys、第462位met中的一個或多個氨基酸殘基替換為其他氨基酸殘基所形成的新氨基酸序列的衍生蛋白質；所述衍生蛋白質對3-異丁基戊二酰亞胺的水解活性高于野生型 gshasewt，在表達量和穩定性方面也優于野生型 gshasewt，其中，野生型 gshasewt的氨基酸序列如seq?id?no.?1所示。
8、優選地，酰胺水解酶突變體的氨基酸序列為如下中的一種：
9、(1)將如seq?id?no.?1所示氨基酸序列的第40位ala替換為val；
10、(2)將如seq?id?no.?1所示氨基酸序列的第63位met替換為glu；
11、(3)將如seq?id?no.?1所示氨基酸序列的第65位phe替換為his；
12、(4)將如seq?id?no.?1所示氨基酸序列的第38位gly替換為thr；
13、(5)將如seq?id?no.?1所示氨基酸序列的第67位gly替換為thr；
14、(6)將如seq?id?no.?1所示氨基酸序列的第94位leu替換為ile；
15、(7)將如seq?id?no.?1所示氨基酸序列的第108位trp替換為cys；
16、(8)將如seq?id?no.?1所示氨基酸序列的第108位trp替換為asp；
17、(9)將如seq?id?no.?1所示氨基酸序列的第155位tyr替換為ser；
18、(10)將如seq?id?no.?1所示氨基酸序列的第157位asp替換為lys；
19、(11)將如seq?id?no.?1所示氨基酸序列的第287位trp替換為ser；
20、(12)將如seq?id?no.?1所示氨基酸序列的第288位ser替換為arg；
21、(13)將如seq?id?no.?1所示氨基酸序列的第317位cys替換為thr；
22、(14)將如seq?id?no.?1所示氨基酸序列的第333位thr替換為gln；
23、(15)將如seq?id?no.?1所示氨基酸序列的第335位ile替換為gln；
24、(16)將如seq?id?no.?1所示氨基酸序列的第336位pro替換為ala；
25、(17)將如seq?id?no.?1所示氨基酸序列的第337位asn替換為met；
26、(18)將如seq?id?no.?1所示氨基酸序列的第341位ile替換為met；
27、(19)將如seq?id?no.?1所示氨基酸序列的第432位cys替換為lys；
28、(20)將如seq?id?no.?1所示氨基酸序列的第462位?met替換為leu；
29、(21)將如seq?id?no.?1所示氨基酸序列的第63位met替換為glu，第65位phe替換為his；
30、(22)將如seq?id?no.?1所示氨基酸序列的第63位met替換為glu，第65位phe替換為his，第317位cys替換為thr；
31、(23)將如seq?id?no.?1所示氨基酸序列的第40位ala替換為val，第63位met替換為glu，第65位phe替換為his；
32、(24)將如seq?id?no.?1所示氨基酸序列的第40位ala替換為val，第63位met替換為glu，第65位phe替換為his，第317位cys替換為thr；
33、(25)將如seq?id?no.?1所示氨基酸序列的第40位ala替換為val，第63位met替換為glu，第65位phe替換為his，第108位trp替換為cys；
34、(26)將如seq?id?no.?1所示氨基酸序列的第40位ala替換為val，第63位met替換為glu，第65位phe替換為his，第108位trp替換為asp，第317位cys替換為thr；
35、(27)將如seq?id?no.?1所示氨基酸序列的第40位ala替換為val，第63位met替換為glu，第65位phe替換為his，第108位trp替換為cys，第317位cys替換為thr；
36、(28)將如seq?id?no.?1所示氨基酸序列的第40位ala替換為val，第63位met替換為glu，第65位phe替換為his，第108位trp替換為cys，第317位cys替換為thr，第338位gly替換為pro，第339位gly替換為pro；
37、(29)將如seq?id?no.?1所示氨基酸序列的第40位ala替換為val，第63位met替換為glu，第65位phe替換為his，第108位trp替換為cys，第317位cys替換為thr，第338位gly替換為pro，第339位gly替換為pro，第341位ile替換為met，
38、(30)將如seq?id?no.?1所示氨基酸序列的第40位ala替換為val，第63位met替換為glu，第65位phe替換為his，第108位trp替換為cys，第317位cys替換為thr，第338位gly替換為pro，第339位gly替換為pro，第341位ile替換為met，第432位cys替換為lys；
39、(31)將如seq?id?no.?1所示氨基酸序列的第40位ala替換為val，第63位met替換為glu，第65位phe替換為his，第108位trp替換為cys，第317位cys替換為thr，第338位gly替換為pro，第339位gly替換為pro，第341位ile替換為met，第432位cys替換為lys，第462位met替換為leu。
40、更優選地，酰胺水解酶突變體的氨基酸序列為如下中的一種：
41、含有m63e突變的突變體，即含有第63位met替換為glu點突變的突變體，包括（2）、（21）、（22）、（23）、（24）、（25）、（26）、（27）、（28）、（29）、（30）、（31）。
42、含有f65h突變的突變體，即含有第65位phe替換為his點突變的突變體，包括（3）、（21）、（22）、（23）、（24）、（25）、（26）、（27）、（28）、（29）、（30）、（31）。
43、再進一步優選地，酰胺水解酶突變體的氨基酸序列為如下中的一種：包括（3）、（5）、（15）、（17）的突變。
44、最優選地，酰胺水解酶突變體的氨基酸序列為如下：
45、將如seq?id?no.?1所示氨基酸序列的第40位ala替換為val，第63位met替換為glu，第65位phe替換為his，第108位trp替換為cys，第317位cys替換為thr，第338位gly替換為pro，第339位gly替換為pro，第341位ile替換為met，第432位cys替換為lys。
46、本發明的技術方案之二，提供了編碼所述酰胺水解酶突變體的核酸。
47、所述編碼基因表達如技術方案一所述的酰胺水解酶突變體，其來源為通過基因工程技術對技術方案一所述的系列酰胺水解酶突變體的基因序列進行克隆。
48、本發明的技術方案之三，提供了含有所述編碼基因的重組表達載體。
49、所述的重組表達載體可通過本領域常規方法將本發明所述的酰胺水解酶基因的核苷酸序列連接于各種市售空載載體上構建而成。所述的市售空載載體可以是本領域常規的各種質粒載體，只要所述重組表達載體可以在相應的表達宿主中正常復制，并表達相應的酰胺水解酶突變體即可。針對不同的表達宿主，優選的質粒載體是不同的。本領域一般技術人員都清楚如何選擇適當的載體、啟動子、增強子和宿主細胞。對于大腸桿菌宿主，所述質粒載體優選為pet28a+。
50、示例的，可通過下述方法制得本發明所述的大腸桿菌重組表達載體：將通過pcr擴增所得的酰胺水解酶突變體基因序列dna片段用限制性內切酶 nde?i和 hind?iii雙酶切，同時將空載質粒pet28a+同樣用限制性內切酶 nde?i和 hind?iii雙酶切，回收上述酶切后的酰胺水解酶突變體的dna片段以及空載質粒，利用t4?dna連接酶連接，構建獲得用于大腸桿菌表達的含有所述酰胺水解酶編碼核酸分子的重組表達載體。
51、本發明的技術方案之四，提供了包含本發明酰胺水解酶突變體基因的重組表達轉化體。
52、所述重組表達轉化體可通過本領域常規技術，將上述重組表達載體轉化至相應宿主細胞中制得，只要能滿足重組共表達載體可穩定地自行復制，并且其所編碼的酰胺水解酶基因能被有效表達即可。所述宿主細胞優選大腸桿菌，更優選大腸桿菌bl21(de3)菌株用于高效表達克隆于含有噬菌體t7啟動子的表達載體（如pet系列）的基因。
53、本發明的技術方案之五，提供一種重組酰胺水解酶變體催化劑，所述的重組酰胺水解酶突變體催化劑是以下形式中的任意一種：
54、(1)培養本發明所述的重組表達轉化體，分離含有所述酰胺水解酶突變體的轉化體細胞；
55、(2)培養本發明所述的重組表達轉化體，分離含有所述酰胺水解酶突變體的轉化體細胞，對含有所述酰胺水解酶突變體的轉化體細胞進行破碎，獲得的含有所述酰胺水解酶突變體的酶液；
56、(3)培養本發明所述的重組表達轉化體，分離含有所述酰胺水解酶突變體的轉化體細胞，對含有所述酰胺水解酶突變體的轉化體細胞進行破碎，獲得含有所述酰胺水解酶突變體的酶液，將含有所述酰胺水解酶突變體的酶液經冷凍干燥而得到的凍干酶粉。
57、其中所述重組表達轉化體的培養方法和條件為本領域常規的方法和條件，針對使用不同宿主構建的重組表達轉化體，采用不同的優選培養方法和條件，只要使重組表達轉化體能夠生長并高效表達本發明所述酰胺水解酶突變體即可。
58、對于重組大腸桿菌bl21菌株，培養基優選tb培養基：甘油5?g/l，蛋白胨?12?g/l，酵母提取物24?g/l，磷酸二氫鉀2.31?g/l，磷酸氫二鉀12.54?g/l，ph?6.0-6.5。優選下述培養方法：將所述重組大腸桿菌接種于含有卡納霉素的液體培養基中培養，培養溫度為37?°c。過夜培養，當培養液的光密度od600達到1.3-2.0?(優選1.5)時，將培養基替換為tb培養基，37?°c培養3?h后加入iptg?(終濃度為0.2?mm)，高效誘導重組大腸桿菌表達本發明所述的重組酰胺水解酶突變體。培養結束后，將培養液高速離心，倒去上清發酵培養液，獲得所述酰胺水解酶突變體的重組表達轉化體細胞。收集的重組細胞放置于?80?℃下冷凍保存，便于后續使用。
59、本發明的技術方案之六，提供了所述酰胺水解酶突變體酶活力的測量方法。
60、挑取單菌落將所述表達重組酰胺水解酶的克隆子從固體培養基中挑到96深孔板中(一級培養板)，在20-30?℃、800?rpm條件下過夜培養。使用移液器從一級培養板轉接到二級培養板，在20-30?℃、800?rpm條件培養2-3?h后，對重組酰胺水解酶突變體進行誘導表達20-24?h，隨后離心去除上清。添加溶菌酶破碎細胞，添加5~10.0?mm?3-異丁基戊二酰亞胺作為篩選底物，在50?mm?、ph?8.5的tris-hcl緩沖液中50?℃、800?rpm條件下反應2?h，取樣0.2?ml后添加0.8?ml甲醇振蕩萃取，終止反應，離心后吸取0.2?ml上清，使用hplc分析產物( r)-3-異丁基戊二酸單酰胺的生成量，計算酶的活力。
61、在本發明的一些實施方式中，酶促反應在ph?6.0~9.0的緩沖液中，25~60?℃條件下進行，反應體系中包括終濃度為10~150?g/l的3-異丁基戊二酰亞胺、1~10.0?mm的金屬離子添加劑，10~800?u/l如技術方案四所述重組酰胺水解酶突變體催化劑。
62、優選地，反應在攪拌狀態下進行，反應時間以底物完全轉化或產物濃度不再繼續上升為準。
63、反應過程間隙取樣0.2?ml反應液，加入?0.8?ml甲醇混合均勻，取0.2?ml混合液加入無水硫酸鈉干燥后，揮發除去甲醇，然后加入0.3?ml乙醇溶解，用0.22?μm孔徑的濾膜過濾后進行液相分析，測定底物的轉化率及產物的ee值，具體分析條件如下：
64、色譜柱為大賽璐chiralpak?c18，流動相為水(0.1%磷酸添加量)：乙腈?＝?60:?40(v/v)，流速為0.5?ml·min-1；柱溫為30?℃，紫外檢測波長為210?nm。
65、色譜柱為大賽璐chiralpak??ad-h，流動相為正己烷：乙醇?＝?88:12?(v/v)，流速為0.5?ml·min-1；柱溫為35?℃，紫外檢測波長為210?nm。
66、本發明的技術方案之七，提供了所述酰胺水解酶突變體或重組酰胺水解酶變體催化劑在制備手性γ-氨基酸類藥物中間體中的應用。
67、優選地，以3-異丁基戊二酰亞胺作為底物，使用所述酰胺水解酶突變體或重組酰胺水解酶變體催化劑，不對稱水解合成( r)-3-異丁基戊二酸單酰胺。
68、優選地，所述反應緩沖液是ph為7.0-9.5的緩沖液，例如tris-hcl、bbs、pbs緩沖液等，但并不受限于此。
69、優選地，所述反應溫度為25-60?°c
70、與現有技術相比，本發明的技術效果主要體現在以下方面：
71、與其它制備光學純γ備氨基丁酸類化合物的生物催化劑相比，本發明提供的酰胺水解酶突變體具有表達量高、催化活性高、穩定性好、底物上載量高等優點，在工業應用中顯示出廣泛的應用前景。