本發明涉及一種用于檢測金黃色葡萄球菌的探針及其應用，屬于免疫分析領域。
背景技術：
1、金黃色葡萄球菌（s.?aureus）作為一種廣泛分布于廢水、食品及臨床環境中的高毒力病原體，可引起器官炎癥、敗血癥、膿毒性休克乃至多器官功能衰竭等嚴重疾病。因此，發展快速、準確且操作簡便的檢測手段對于及時防控金黃色葡萄球菌感染、優化臨床治療及保障公共健康具有重要意義。
2、目前，針對金黃色葡萄球菌的檢測仍以培養法為“金標準”，該方法準確性較高，但耗時長達24–48小時，對可存活但不可培養狀態的細菌易產生假陰性結果，且存在生物安全風險。為提升檢測效率，分子生物學與免疫學方法已被廣泛用于金黃色葡萄球菌的快速篩查。分子檢測技術如聚合酶鏈式反應（pcr）等雖具有較高靈敏度（例如中國專利cn202411109634.0公開的引物組及檢測試劑盒），但其操作復雜、依賴精密儀器和專業人員的限制，影響了其在現場快速檢測中的適用性。相比之下，免疫學方法憑借其快速、簡便和便于攜帶的特點，在金黃色葡萄球菌檢測中展現出顯著優勢，例如中國專利cn202510255539.x報道的檢測耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的試紙條。然而，現有免疫分析法多依賴于傳統單克隆抗體作為識別探針，存在制造成本高、穩定性不足、靈敏度有限等問題。此外，金黃色葡萄球菌表面表達的葡萄球菌蛋白a（spa）能夠非特異性結合抗體的fc段，導致檢測信號失真，使得現有方法多限于菌分泌物的定量或菌體的定性分析，嚴重影響檢測結果的準確性。因此，開發具有更高親和力、更強穩定性及更強環境適應性的新型納米抗體探針，成為提升金黃色葡萄球菌免疫檢測性能的關鍵方向。
3、噬菌體展示納米抗體因其分子量小、無fc片段（可避免spa干擾）、易改造為多價高親和力構象、以及卓越的穩定性與耐受性，被視為構建下一代金黃色葡萄球菌快速檢測工具的優選材料。尤其值得指出的是，通過利用spa與抗體fc段的特異性結合，可將噬菌體展示的納米抗體與常規抗體靈活配對，快速組裝成高性能的檢測探針，從而規避傳統配對篩選過程的高成本與低效問題，為發展靈敏、可靠且易于推廣的免疫檢測新方法提供了有效途徑。
技術實現思路
1、發明目的：本發明的目的是提供一種用于檢測金黃色葡萄球菌的探針及其應用。
2、技術方案：本發明提供一種靶向金黃色葡萄球菌的納米抗體，其氨基酸序列如seqid?no：4所示。通過配對實驗得出噬菌體展示納米抗體可做為通用型探針，與多種抗體具有良好的配對效果，能形成配對抗體用于免疫傳感器中。
3、本發明還提供一種編碼所述納米抗體，其核苷酸序列如下所示：
4、sa2（seq?id?no.5）：?cagttgcagctcgtggagtcggggggaggattggtgcaggctgggggctccatgagactctcctgtgcagcctctggacgcaccttcagtacgaataccatgggctggttccgccaggctccagggaaggagcgtgagtttgtagcaggtattaggtggattagtggtagcacaagctatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaacacgctctttctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacacggccgtgtattactgtgcggcgggcccccataatataccgatacttcgtacttcggcttataactactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca；
5、sa10（seq?id?no.6）：
6、gaggtgcagctggtggagtcggggggaggattggtgcaggctgggggctctctgagactctcctgtgcaacctctggacgcaccttcagtaccttcagtacctatgtcgcgggctggttccgccaggctccagggaaggagcgtgagtttgtagcagctattaggcggactggtggtcgcacatactatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccggagacaacgccaagaacatggtgtatctgcaaatgaacagcctgaaacctgaggacacggccacttattactgtgcagcagctaacaacctgggtagcgactatgtgacagtgacgggaaagtatgactactggggccaggggacccaggtcatcgtctcctca；
7、sa31（seq?id?no.7）：
8、cagttgcagctcgtggagtcggggggaggcttggtgcaggctggggactctctgagactctcctgtgtactctctggacgcaccttcagtaactatggcatgtactggttccgccaggctccagggaaggagcgtgaaggtgtagcaggtattgcgtggcgtgggggcggcactatttatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacaacgccaagaacacggtctatctacagctgaacagcctgaaacctgaggacacggccgtttatttctgtggagcactagtgttcggcggtggtaggtgggaaagacctgcccactggggccaggggacccaggtcaccgtctcctca；
9、sa46（seq?id?no.8）：
10、caggtgcagctcgtggagtcaggtggaggcttggtgcagcctggggggtctctgagactctcctgtataacctctggaagccgcttcagattcggtgcggggtggtaccgccaggctccagggaagtcccgcgagcgagtcgcggctattaattttggtagttttacaaattatgcagactccgtgaagggccgattcaccatctccagagacgacgccgcgaacaccttgtatctgcaaatgaacaacctgagacctgaagacacggccgtctattactgtaatacagggaattactggggcgaggggacccaggtcaccgtctcctca。
11、本發明還提供所述納米抗體在制備靶向金黃色葡萄球菌的納米抗體探針中的應用。
12、本發明還提供一種靶向金黃色葡萄球菌的納米抗體探針，其含有所述納米抗體。
13、本發明還提供所述納米抗體或所述納米抗體探針在制備金黃色葡萄球菌檢測試劑盒中的應用。
14、本發明還提供一種金黃色葡萄球菌檢測試劑盒，其含有所述納米抗體或所述納米抗體探針。
15、其中，其還含有電化學生物傳感器，所述電化學生物傳感器為三電極體系：工作電極、對電極和參比電極；所述工作電極為修飾有金納米顆粒的絲網印刷電極，所述金納米顆粒連接有fc片段，fc片段的表面有牛血清白蛋白（bsa）進行封閉；對電極為鉑絲；參比電極為飽和甘汞電極。
16、本發明將篩選的每株噬菌體展示納米抗體分別與fc片段配對，證明了獲取的噬菌體展示納米抗體作為探針的高性能，并篩選出多對高靈敏、強特異性的配對抗體，主要包含以下步驟：
17、（1）fc片段包被于酶標孔中，過夜孵育；
18、（2）0.03%?pbst洗板5次，3?%脫脂奶粉37℃孵育1-2?h；
19、（3）0.03%?pbst洗板5次，加入不同稀釋梯度（0-108?cfu/ml）的滅活后的金黃色葡萄球菌，37℃孵育1h；
20、（4）0.03%?pbst洗板5次，投入1011-1012?cfu篩選的噬菌體展示納米抗體，37℃孵育45-60?min；
21、（5）?0.03%?pbst洗板5次，每孔加入100?μl抗m13二抗，37℃孵育45-60?min；
22、（6）0.03%?pbst洗板5次，依次加入100?μl?tmb顯色液和50?μl?硫酸終止液，37℃孵育10-15min并進行鑒定。
23、（7）根據記錄的數據，使用軟件進行標準曲線擬合，算出最低檢測限。
24、本發明還提供所述納米抗體、所述納米抗體探針或所述金黃色葡萄球菌檢測試劑盒在金黃色葡萄球菌檢測中的應用。
25、本發明還提供一種利用所述納米抗體探針檢測金黃色葡萄球菌的方法，包括以下步驟：
26、（1）將樣品溶液滴加在電化學生物傳感器的工作電極表面，孵育，使用磷酸鹽緩沖鹽水對電極表面進行充分洗滌，再在工作電極表面滴加納米抗體探針（hrp酶標記的噬菌體展示納米抗體），孵育，清洗，吹干，并將電化學生物傳感器置于含有鄰苯二酚和過氧化氫的cbs緩沖液，連接至電化學工作站進行方波伏安測試；
27、（2）當使用噬菌體展示納米抗體sa-2做為納米抗體探針，且電流超過3.69?μa時，證明樣品溶液中存在金黃色葡萄球菌；當使用噬菌體展示納米抗體sa-10做為納米抗體探針，且電流超過2.09?μa時，證明樣品溶液中存在金黃色葡萄球菌；當使用噬菌體展示納米抗體sa-31做為納米抗體探針，且電流超過1.76?μa時，證明樣品溶液中存在金黃色葡萄球菌；當使用噬菌體展示納米抗體sa-46做為納米抗體探針，且電流超過1.89?μa時，證明樣品溶液中存在金黃色葡萄球菌。
28、本發明還提供一種利用所述納米抗體探針定量檢測金黃色葡萄球菌濃度的方法，包括以下步驟：
29、（1）將樣品溶液滴加在電化學生物傳感器的工作電極表面，孵育，使用磷酸鹽緩沖鹽水對電極表面進行充分洗滌，再在工作電極表面滴加納米抗體探針（hrp酶標記的噬菌體展示納米抗體），孵育，清洗，吹干，并將電化學生物傳感器置于含有鄰苯二酚和過氧化氫的cbs緩沖液，連接至電化學工作站進行方波伏安測試；
30、（2）當使用噬菌體展示納米抗體sa-2做為納米抗體探針時，根據標準曲線?y?=1.12x＋0.23計算金黃色葡萄球菌的濃度，最低檢測限為158?cfu/ml；當使用噬菌體展示納米抗體sa-10做為納米抗體探針時，根據標準曲線y?=?1.05x-0.77計算金黃色葡萄球菌的濃度，最低檢測限為725?cfu/ml；當使用噬菌體展示納米抗體sa-31做為納米抗體探針時，根據標準曲線y?=?1.08x-1.07計算金黃色葡萄球菌的濃度，最低檢測限為447?cfu/ml；當使用噬菌體展示納米抗體sa-46做為納米抗體探針時，根據標準曲線y?=?1.07x-1.733計算金黃色葡萄球菌的濃度，最低檢測限為2455?cfu/ml；其中，x為金黃色葡萄球菌的濃度（cfu/ml），y為電流（μa）。
31、其中，所述方波伏安測試的參數設置為：階梯電壓（△es）為0.005?v，掃描電位范圍為0–0.6?v，方波振幅（△esw）為0.025?v，頻率(f)為25?hz。
32、其中，所述基因的核苷酸序列如seq?id?no：5~8任一條所示。
33、其中，如seq?id?no：5~8所示的序列依次為sa-2、sa-10、sa-31和sa-46納米抗體的核苷酸序列。
34、本發明將上述配對的噬菌體展示納米抗體和fc片段分別作為包被抗體與標記抗體開發夾心式傳感器，包被抗體為fc片段，標記抗體為辣根過氧化物（hrp）酶標噬菌體展示納米抗體，主要包含以下步驟：
35、（1）將處理后的絲網印刷電極浸泡在1%?haucl4溶液中，接入三電極體系，并通過循環伏安法對電極表面進行金納米顆粒的沉積，掃描圈數為3?-?9圈，經超純水清洗、氮氣吹干，于3-巰基丙酸（mpa）溶液中避光自組裝過夜。
36、（3）電極表面滴加含0.05?-?0.1?mm?edc/nhs的0.01?m?pb緩沖液，反應完成后，依次滴加5?-10?μg/ml?fc片段和1%?bsa反應，再次用超純水清洗電極并氮氣吹干。每步修飾后，將電極浸入5?mm?鐵氰化鉀/亞鐵氰化鉀（[fe(cn)6]3-/4-）底液（含0.1?m?kcl），通過循環伏安法（cv）或電化學阻抗譜（eis）實時監測修飾過程。
37、（4）將含有不同濃度的滅活金黃色葡萄球菌的加標樣本按濃度范圍0–108?cfu/ml稀釋，滴加至絲網印刷電極的表面。反應完成后，分別加入hrp酶標記的噬菌體展示納米抗體，孵育。
38、（5）超純水清洗電極，并將其置于含有2×10-5?m鄰苯二酚和7×10-5?m過氧化氫的cbs緩沖液中（由5×10-2?m檸檬酸鹽與5×10-2?m磷酸緩沖液（pb）混合，并調節ph至5.0），進行方波伏安（swv）檢測。通過記錄檢測過程中的數據，并結合濃度與氧化還原峰的相關性，繪制標定曲線，以計算其線性范圍和最低檢測濃度。
39、有益效果：與現有技術相比，本發明具有如下顯著優點：
40、（1）與傳統的單克隆抗體相比，本發明的噬菌體展示納米抗體具有靈敏度高、穩定性強、成本較低、易于修飾、生物安全性高等優點。
41、（2）傳統的單克隆抗體受到fc端與金葡spa結合的影響，難以實現金黃色葡萄球菌的直接檢測，只能間接檢測細菌分泌的毒性物質，難以準確評估病人、水源、食品等樣本的感染或污染情況，本發明篩選的噬菌體展示納米抗體可以實現金黃色葡萄球菌的直接檢測，具有高準確性。
42、（3）本發明構建的夾心傳感器能實現158?-?2455?cfu/ml的檢測限，遠低于現有免疫學方法。
43、（4）本發明構建的夾心傳感器可在1分鐘內定性檢測金黃色葡萄球菌，檢測速度快、特異性強、準確性高，可實現金黃色葡萄球菌的多場景、即時、原位的檢測。
44、（5）本發明提供一條全新的抗金黃色葡萄球菌納米抗體序列，該序列在保留噬菌體展示納米抗體諸多優勢的同時，展現出更高的結合活性與穩定性，有望用于開發性能進一步提升的金黃色葡萄球菌檢測試劑。