本發明涉及代謝工程及基因工程，尤其是一種l-蘇氨酸生產菌株及其構建方法與應用。
背景技術：
1、l-蘇氨酸作為三大氨基酸之一，在飼料、食品、醫藥及化妝品等領域具有重要的應用價值。目前，l-蘇氨酸的生產方法主要包括蛋白質水解法、化學合成法及微生物發酵法。其中，蛋白質水解法原料成本高、分離純化步驟繁瑣且收率偏低；化學合成法則存在反應路徑復雜、手性拆分難度大、環境污染較嚴重等問題，難以滿足綠色制造的發展需求。相較而言，微生物發酵法具有反應條件溫和、原料來源廣泛、環境兼容性好等優勢，已成為工業化生產l-蘇氨酸的主流技術。
2、當前，采用微生物發酵法生產l-蘇氨酸已成為高效、經濟且環境友好的工業化成熟工藝，其產量規模在全球氨基酸產業中位居第三，僅次于谷氨酸和賴氨酸。該方法一般以葡萄糖等可再生碳源為底物，利用經代謝工程改造的微生物菌株進行定向發酵合成。近年來，隨著合成生物學與系統代謝工程技術的進步，通過對大腸桿菌、谷氨酸棒桿菌等模式菌株進行理性改造，已在相當程度上解除了l-蘇氨酸生物合成途徑中的反饋抑制，強化了前體物質供應與輔因子再生系統，從而提升了菌株的發酵性能。然而，現有生產菌株在l-蘇氨酸產量、碳源轉化率及工藝穩定性方面仍存在進一步提升的空間。因此，構建一株遺傳背景清晰、生產性能穩定、高產l-蘇氨酸的微生物菌株，仍是本領域亟待解決的關鍵技術問題。
技術實現思路
1、本發明所要解決的技術問題在于提供一種l-蘇氨酸生產菌株。
2、本發明所要解決的另一技術問題在于提供上述l-蘇氨酸生產菌株的構建方法。
3、本發明所要解決的另一技術問題在于提供上述l-蘇氨酸生產菌株的應用。
4、為解決上述技術問題，本發明的技術方案是：
5、一種l-蘇氨酸生產菌株，是以棒狀桿菌屬菌株作為出發菌株的基礎上進行改造獲得的，所述改造包括：敲除出發菌株中的異亮氨酸轉運蛋白基因 brnf；過表達來自大腸桿菌的l-蘇氨酸的外源外排蛋白基因 rhtc。
6、優選的，上述l-蘇氨酸生產菌株，所述棒狀桿菌屬菌株為谷氨酸棒狀桿菌。
7、優選的，上述l-蘇氨酸生產菌株，所述谷氨酸棒狀桿菌為 c.glutamicumatcc13032。
8、優選的，上述l-蘇氨酸生產菌株，改造通過在 brnf位點整合包含來自大腸桿菌的l-蘇氨酸的外源外排蛋白基因 rhtc的人工操縱子實現。
9、優選的，上述l-蘇氨酸生產菌株，改造中過表達來自大腸桿菌的l-蘇氨酸的外源外排蛋白基因 rhtc還通過在假基因位點整合包含來自大腸桿菌的l-蘇氨酸的外源外排蛋白基因 rhtc的人工操縱子實現。
10、優選的，上述l-蘇氨酸生產菌株，所述假基因位點為cg1742假基因位點。
11、優選的，上述l-蘇氨酸生產菌株，所述包含來自大腸桿菌的l-蘇氨酸的外源外排蛋白基因 rhtc的人工操縱子還包括啟動子，具體基因順序包括啟動子、 rhtc，命名為人工操縱子p- rhtc。
12、優選的，上述l-蘇氨酸生產菌株，所述人工操縱子所包括的啟動子選自：psod啟動子、ptrc啟動子、ptuf啟動子、ph36啟動子、plac啟動子、ptrp啟動子、ptac啟動子、plpl啟動子或ppgk100啟動子中任意一種。
13、優選的，上述l-蘇氨酸生產菌株，所述人工操縱子中啟動子為psod啟動子，命名為人工操縱子psod- rhtc，psod和 rhtc首尾順序連接，其中，psod啟動子的核苷酸序列如序列表seq?id?no.13所示， rhtc的核苷酸序列如序列表seq?id?no.22所示，氨基酸序列如序列表seq?id?no.23所示，或與該序列一致性為95%以上且來源于相同種屬。
14、優選的，上述l-蘇氨酸生產菌株，所述人工操縱子中啟動子為ph36啟動子，命名為人工操縱子ph36- rhtc，ph36和 rhtc首尾順序連接，其中，ph36啟動子的核苷酸序列如序列表seq?id?no.24所示， rhtc的核苷酸序列如序列表seq?id?no.22所示，氨基酸序列如序列表seq?id?no.23所示，或與該序列一致性為95%以上且來源于相同種屬。
15、優選的，上述l-蘇氨酸生產菌株，所述人工操縱子由人工啟動子控制操縱子開始轉錄，由基因組中的天然終止子控制操縱子終止轉錄。
16、優選的，上述l-蘇氨酸生產菌株，所述改造還包括：敲除出發菌株中的賴氨酸轉運蛋白基因 lyse；過表達來自大腸桿菌的蘇氨酸合成酶基因 thrc、高絲氨酸激酶基因 thrb、具有雙重功能的天冬氨酸激酶\高絲氨酸脫氫酶基因 thra。
17、優選的，上述l-蘇氨酸生產菌株，改造通過在 lyse位點上整合包含來自大腸桿菌的蘇氨酸合成酶基因 thrc、高絲氨酸激酶基因 thrb、具有雙重功能的天冬氨酸激酶\高絲氨酸脫氫酶基因 thra的人工操縱子實現。
18、優選的，上述l-蘇氨酸生產菌株，所述包含來自大腸桿菌的蘇氨酸合成酶基因 thrc、高絲氨酸激酶基因 thrb、具有雙重功能的天冬氨酸激酶\高絲氨酸脫氫酶基因 thra的人工操縱子還包括啟動子，具體基因順序包括啟動子、 thra、 thrb和 thrc，命名為人工操縱子p- thra- thrb- thrc。
19、優選的，上述l-蘇氨酸生產菌株，所述人工操縱子所包括的啟動子選自：psod啟動子、ptrc啟動子、ptuf啟動子、ph36啟動子、plac啟動子、ptrp啟動子、ptac啟動子、plpl啟動子或ppgk100啟動子中任意一種。
20、優選的，上述l-蘇氨酸生產菌株，所述人工操縱子中啟動子為psod啟動子（啟動子psod的核苷酸序列如序列表seq?id?no.13所示）,命名為人工操縱子psod- thra- thrb- thrc，其核苷酸序列如序列表seq?id?no.15所示。
21、優選的，上述l-蘇氨酸生產菌株，所述人工操縱子，由人工啟動子控制操縱子開始轉錄，由基因組中的天然終止子控制操縱子終止轉錄。
22、優選的，上述l-蘇氨酸生產菌株，是進一步改造獲得的，所述進一步改造包括：過表達來源于谷氨酸棒桿菌的蘇氨酸合成酶基因 thrc、來源于谷氨酸棒桿菌的攜帶突變位點的高絲氨酸激酶基因 thrb(a20g)、攜帶突變位點的高絲氨酸脫氫酶基因 hom(g378e)、天冬氨酸半醛脫氫酶基因 asd、攜帶突變位點的天冬氨酸激酶基因 lysc(t311i)和天冬氨酸轉氨酶基因 aspb。
23、優選的，上述l-蘇氨酸生產菌株，所述改造方法是利用鏈霉素篩選載體同源重組編輯技術完全在出發菌株染色體基因組上進行改造。
24、優選的，上述l-蘇氨酸生產菌株，所述 thrb(a20g)是 thrb基因（所述 thrb基因來源于谷氨酸棒桿菌，其核苷酸序列如序列表seq?id?no.27所示，氨基酸序列如序列表seq?idno.28所示，或與該序列一致性為95%以上且來源于相同種屬）進行了點突變后得到的，即第59位堿基由c變為g、第60位堿基由a變為c，導致第20位氨基酸殘基由丙氨酸變為甘氨酸； hom(g378e)是 hom基因進行了點突變后得到的，即第1133位堿基由g變為a、第1134位堿基由g變為a，導致第378位氨基酸殘基由甘氨酸變為谷氨酸； lysc(t311i)是 lysc基因進行了點突變后得到的，即第932位堿基由c變為t，導致第311位氨基酸殘基由蘇氨酸變為異亮氨酸；大腸桿菌w3110來源的具有雙重功能的天冬氨酸激酶\高絲氨酸脫氫酶基因 thra。
25、優選的，上述l-蘇氨酸生產菌株，用人工啟動子psod替換蘇氨酸合成酶基因 thrc、高絲氨酸脫氫酶基因 hom(g378e)和天冬氨酸激酶基因 lysc(t311i)的天然啟動子，用人工啟動子ptuf替換天冬氨酸轉氨酶基因 aspb的天然啟動子。
26、優選的，上述l-蘇氨酸生產菌株，所述蘇氨酸合成酶基因 thrc的核苷酸序列如序列表seq?id?no.1所示，氨基酸序列如序列表seq?id?no.2所示，或與該序列一致性為95%以上且來源于相同種屬；所述高絲氨酸脫氫酶基因 hom(g378e)的核苷酸序列如序列表seq?idno.3所示，氨基酸序列如序列表seq?id?no.4所示，或與該序列一致性為95%以上且來源于相同種屬（ hom的核苷酸序列如序列表seq?id?no.5所示，氨基酸序列如序列表seq?id?no.6所示，或與該序列一致性為95%以上且來源于相同種屬）；所述天冬氨酸激酶基因 lysc(t311i)的核苷酸序列如序列表seq?id?no.7所示，氨基酸序列如序列表seq?id?no.8所示，或與該序列一致性為95%以上且來源于相同種屬（ lysc的核苷酸序列如序列表seq?id?no.9所示，氨基酸序列如序列表seq?id?no.10所示，或與該序列一致性為95%以上且來源于相同種屬）；所述天冬氨酸轉氨酶基因 aspb的核苷酸序列如序列表seq?id?no.11所示，氨基酸序列如序列表seq?id?no.12所示，或與該序列一致性為95%以上且來源于相同種屬；所述啟動子psod的核苷酸序列如序列表seq?id?no.13所示，所述啟動子ptuf的核苷酸序列如序列表seqid?no.14所示。
27、優選的，上述l-蘇氨酸生產菌株，所述大腸桿菌w3110來源的蘇氨酸合成酶基因 thrc的核苷酸序列如序列表seq?id?no.16所示，氨基酸序列如序列表seq?id?no.17所示，或與該序列一致性為95%以上且來源于相同種屬；高絲氨酸激酶基因 thrb的核苷酸序列如序列表seq?id?no.18所示，氨基酸序列如序列表seq?id?no.19所示，或與該序列一致性為95%以上且來源于相同種屬； thrb(a20g)的核苷酸序列如序列表seq?id?no.25所示，氨基酸序列如序列表seq?id?no.26所示，或與該序列一致性為95%以上且來源于相同種屬；具有雙重功能的天冬氨酸激酶\高絲氨酸脫氫酶基因 thra的核苷酸序列如序列表seq?id?no.20所示，氨基酸序列如序列表seq?id?no.21所示，或與該序列一致性為95%以上且來源于相同種屬，并用人工啟動子psod調控。
28、優選的，上述l-蘇氨酸生產菌株，所述大腸桿菌w3110來源的蘇氨酸轉運蛋白基因 rhtc的核苷酸序列如序列表seq?id?no.22所示，氨基酸序列如序列表seq?id?no.23所示，或與該序列一致性為95%以上且來源于相同種屬，并用人工啟動子ph36調控，所述人工啟動子ph36的核苷酸序列如序列表seq?id?no.24所示，在 brnf位點整合人工操縱子psod- rhtc，所述大腸桿菌w3110的蘇氨酸轉運蛋白基因 rhtc用人工啟動子psod調控。
29、一種l-蘇氨酸生產菌株的構建方法，以棒狀桿菌屬菌株作為出發菌株，敲除出發菌株中的異亮氨酸轉運蛋白基因 brnf；過表達來自大腸桿菌的l-蘇氨酸的外源外排蛋白基因 rhtc。
30、優選的，上述l-蘇氨酸生產菌株的構建方法，在 brnf位點整合包含來自大腸桿菌的l-蘇氨酸的外源外排蛋白基因 rhtc的人工操縱子；在假基因位點整合包含來自大腸桿菌的l-蘇氨酸的外源外排蛋白基因 rhtc的人工操縱子。
31、優選的，上述l-蘇氨酸生產菌株的構建方法，還包括敲除出發菌株中的賴氨酸轉運蛋白基因 lyse；過表達來自大腸桿菌的蘇氨酸合成酶基因 thrc、高絲氨酸激酶基因 thrb、具有雙重功能的天冬氨酸激酶\高絲氨酸脫氫酶基因 thra。
32、優選的，上述l-蘇氨酸生產菌株的構建方法，在 lyse位點上整合包含來自大腸桿菌的蘇氨酸合成酶基因 thrc、高絲氨酸激酶基因 thrb、具有雙重功能的天冬氨酸激酶\高絲氨酸脫氫酶基因 thra的人工操縱子，同時進行進一步改造：過表達蘇氨酸合成酶基因 thrc、攜帶突變位點的高絲氨酸激酶基因 thrb(a20g)、攜帶突變位點的高絲氨酸脫氫酶基因 hom(g378e)、天冬氨酸半醛脫氫酶基因 asd、攜帶突變位點的天冬氨酸激酶基因 lysc(t311i)和天冬氨酸轉氨酶基因 aspb。
33、優選的，上述l-蘇氨酸生產菌株的構建方法，具體步驟如下：
34、（1）在上述出發菌株基因組上,?敲除異亮氨酸轉運蛋白基因 brnf，在cg1742位點上整合人工操縱子ph36- rhtc，在 brnf位點整合人工操縱子psod- rhtc，加強l-蘇氨酸的外排能力；
35、（2）通過用強啟動子psod替換 lysc(t311i)、 hom(g378e)和 thrb(a20g)的天然啟動子解除反饋抑制；
36、（3）通過用強啟動子psod替換 thrc，強啟動子ptuf替換 aspb的天然啟動子；
37、（4）敲除賴氨酸轉運蛋白基因 lyse，在 lyse位點上整合人工操縱子p- thra- thrb- thrc或人工操縱子psod- thra- thrb- thrc，加強l-蘇氨酸的合成途徑。
38、優選的，上述l-蘇氨酸生產菌株的構建方法，所述出發菌株為谷氨酸棒狀桿菌。
39、優選的，上述l-蘇氨酸生產菌株的構建方法，所述出發菌株為谷氨酸棒狀桿菌 c.glutamicumatcc?13032。
40、上述l-蘇氨酸生產菌株在發酵生產l-蘇氨酸中的應用。
41、優選的，上述l-蘇氨酸生產菌株的應用，使用搖瓶發酵生產l-蘇氨酸，具體步驟如下：
42、（1）種子活化及種子培養：接種菌液均勻涂布于活化斜面培養后轉接至種子培養基中進行種子培養；
43、（2）發酵培養；將種子液接入發酵培養基中，振蕩培養，添加碳酸鈣，間歇流加氫氧化鈉控制ph在7.0左右。
44、優選的，上述l-蘇氨酸生產菌株的應用，使用搖瓶發酵生產l-蘇氨酸，具體步驟如下：
45、（1）種子活化及種子培養：從保菌管中接種菌液均勻涂布于活化斜面，32℃培養12h，轉接活化斜面繼續培養10h，再轉接至含5ml種子培養基的搖管中進行種子培養；
46、（2）發酵培養；按5%接種量將種子液1.5ml接入裝有30ml發酵培養基的500ml三角瓶中，紗布封口，置巡回式搖床(200r/min)上，31.5℃振蕩培養70h，添加碳酸鈣2%，間歇流加氫氧化鈉控制ph在7.0左右。
47、優選的，上述的l-蘇氨酸生產菌株的應用，種子活化中采用的斜面培養基為：葡萄糖1.0-3.0g/l，蛋白胨8.0-12.0g/l，酵母粉4.0-6.0g/l，尿素1.0-3.0g/l，磷酸二氫鉀1.0-2.0g/l，硫酸鎂0.3-0.5g/l，vh、vb1、vb3、vb5各1.0-3.0mg/l，瓊脂粉20-30?g/l，ph7.0～7.2。
48、優選的，上述的l-蘇氨酸生產菌株的應用，種子活化中采用的斜面培養基為：葡萄糖2.0g/l，蛋白胨10.0g/l，酵母粉5.0g/l，尿素2.0g/l，磷酸二氫鉀1.5g/l，硫酸鎂0.4g/l，vh、vb1、vb3、vb5各2.0mg/l，瓊脂粉25?g/l，ph7.0～7.2。
49、優選的，上述的l-蘇氨酸生產菌株的應用，種子培養中采用的種子培養基為：葡萄糖25.0-35.0g/l，酵母粉0.5-1.5g/l，玉米漿干粉4.0-6.0g/l，硫酸銨1.0-3.0g/l，硫酸鎂0.6-1.0g/l，磷酸二氫鉀2.0-4.0g/l，l-異亮氨酸0.4-0.6g/l，硫酸亞鐵8.0-12.0mg/l，硫酸錳8.0-12.0mg/l，生物素8.0-12.0mg/l，vb1、vb3、vb5各1.0-3.0mg/l，l-蛋氨酸0.4-0.6g/l，消泡劑0.4-0.6mg/l，ph7.0～7.2。
50、優選的，上述的l-蘇氨酸生產菌株的應用，種子培養中采用的種子培養基為：葡萄糖30.0g/l，酵母粉1.0g/l，玉米漿干粉5.0g/l，硫酸銨2.0g/l，硫酸鎂0.8g/l，磷酸二氫鉀3.0g/l，l-異亮氨酸0.5g/l，硫酸亞鐵10.0mg/l，硫酸錳10.0mg/l，生物素10.0mg/l，vb1、vb3、vb5各2.0mg/l，l-蛋氨酸0.5g/l，消泡劑0.5mg/l，ph7.0～7.2。
51、優選的，上述的l-蘇氨酸生產菌株的應用，發酵培養中采用的發酵培養基為：葡萄糖35.0-45.0g/l，糖蜜8.0-12.0g/l，玉米漿干粉8.0-12.0g/l，磷酸二氫鉀0.5-1.5g/l，硫酸銨4.0-6.0g/l，硫酸鎂1.0-2.0g/l，l-蛋氨酸0.1-0.3g/l，硫酸錳8.0-12.0mg/l，硫酸鋅1.0-3.0mg/l，硫酸亞鐵8.0-12.0mg/l，vb1、vb3、vb5各1.0-3.0mg/l，生物素0.01-0.03mg/l，l-異亮氨酸0.5-0.7g/l，消泡劑0.4-0.6mg/l，接種量20-40%，ph7.0～7.2。
52、優選的，上述的l-蘇氨酸生產菌株的應用，發酵培養中采用的發酵培養基為：葡萄糖40.0g/l，糖蜜10.0g/l，玉米漿干粉10.0g/l，磷酸二氫鉀1.0g/l，硫酸銨5.0g/l，硫酸鎂1.5g/l，l-蛋氨酸0.2g/l，硫酸錳10.0mg/l，硫酸鋅2.0mg/l，硫酸亞鐵10.0mg/l，vb1、vb3、vb5各2.0mg/l，生物素0.02mg/l，l-異亮氨酸0.6g/l，消泡劑0.5mg/l，接種量30%，ph7.0～7.2。
53、上述培養基均可采用標準方法制備獲得。
54、有益效果：
55、上述l-蘇氨酸生產菌株，利用同源重組基因編輯技術，敲除賴氨酸轉運蛋白基因 lyse和異亮氨酸轉運蛋白基因 brnf，首先過表達蘇氨酸抑制的 lysc(t311i)、 hom(g378i)和 thrb(a20g)；過表達 thrc和 aspb；異源引入且多拷貝大腸桿菌來源的 thra- thrb- thrc基因和外排蛋白 rhtc基因 ，其中 thra- thrb- thrc是通過人工操縱子psod- thra- thrb- thrc來進行同步多拷貝的。所構建的菌株不含質粒，無缺陷，無需誘導，具有遺傳穩定性好、發酵產率高等優勢，是可穩定生產l-蘇氨酸的優良菌株，所述菌株以葡萄糖為底物從頭高效合成l-蘇氨酸，經過36h搖瓶發酵，l-蘇氨酸產量可高達45g/l。