本發明涉及核酸提取,具體而言,涉及一種核酸的提取方法和選擇性沉淀劑。
背景技術:
1、陰道分泌物檢測是婦科常規檢查項目,用于診斷陰道炎、宮頸炎及性傳播感染。傳統方法包括涂片鏡檢、培養法等,這些方法存在耗時長、靈敏度低、無法覆蓋不可培養微生物等局限性。分子檢測技術(如多重pcr、基因芯片、ngs)具有快速、靈敏、高通量等優勢,已成為病原體檢測的重要發展方向。然而,陰道拭子樣本成分復雜,其特殊性對核酸提取提出挑戰:(1)抑制物含量高:樣本中含有大量宿主上皮細胞、黏液(主要成分為黏蛋白)、乳酸桿菌代謝產物(如乳酸)以及可能存在的血液成分,這些物質都是pcr等分子擴增反應的強抑制劑。(2)微生物種類多樣且細胞壁結構差異大:需同時處理革蘭氏陽性菌(如加德納菌、鏈球菌)、革蘭氏陰性菌(如淋球菌)、真菌(如白色念珠菌)和病毒(如人乳頭瘤病毒hpv),其細胞壁/膜結構不同,對裂解條件的耐受性差異顯著。(3)病原體載量可能較低:尤其在感染早期或攜帶狀態,目標病原體核酸量遠低于宿主dna背景,要求提取方法具有高獲得率和高純度。
2、現階段對于從陰道拭子樣本中提取病原微生物核酸的方法主要基于病原體浸泡在保存液中、蛋白酶消化、以及基于dna核酸捕獲與純化獲得。其中,陰道拭子樣本浸泡在樣本保存液,通過充分震蕩使病原微生物脫落釋放在保存液中;蛋白酶法消化分解蛋白并釋放核酸,以提高病原微生物核酸的回收率。核酸的捕獲與純化包括磁珠法和離心柱法;磁珠法通過磁珠與dna結合,利用磁場分離,配合乙醇漂洗去除雜質,最終用洗脫液獲得高純度核酸;離心柱法使用硅膠膜吸附dna,經多次洗滌后洗脫,用洗脫液獲得高純度核酸?,F有的離心柱法將樣本釋放的基因組dna混合液與膜柱混合,抑制劑(樣本中存在的干擾雜質)和核酸競爭性結合,導致純化效果不佳和核酸丟失。
3、鑒于此,特提出本發明。
技術實現思路
1、本發明的目的在于提供一種核酸的提取方法和選擇性沉淀劑。
2、本發明是這樣實現的:
3、第一方面,本發明實施例提供了一種核酸的提取方法,其包括以下步驟:
4、獲取待測樣本經裂解后獲得的裂解液;
5、在所述裂解液中添加選擇性沉淀劑進行沉淀,靜置和/或離心后,取上清液;其中,所述選擇性沉淀劑包括含0.1%~2%w/v殼聚糖或0.1%~2%w/v殼聚糖衍生物的溶液;
6、對所述上清液中的核酸進行捕獲或純化。
7、第二方面,本發明實施例提供了一種選擇性沉淀劑,其包括:前述實施例所述的選擇性沉淀劑。
8、本發明具有以下有益效果:
9、本發明提供了一種從陰道拭子樣本中提取細菌和真菌核酸的方法,該提取方法通過采用選擇性沉淀劑先將待測樣本中的抑制劑進行高效沉淀,使抑制劑與樣本中的目標核酸分離,再對待測樣本中的核酸進行捕獲和純化,從根本上減輕后續洗滌步驟的競爭,縮短洗滌過程的時間,提高核酸的得率和純度,特別有利于保護低濃度、短片段核酸,該提取方法具有操作時長短、提取效率高、重現性和穩定性好等優勢,能夠對低生物量樣本進行核酸的高效提取,為高靈敏度的陰道拭子分子生物學檢測提供了途徑。
1.一種核酸的提取方法,其特征在于,其包括以下步驟:
2.根據權利要求1所述的提取方法,其特征在于,所述殼聚糖的脫乙酰度為低脫乙酰度、中脫乙酰度、高脫乙酰度或超高乙酰度;所述低脫乙酰度為≥75%,所述中脫乙酰度為≥85%,所述高脫乙酰度為≥90%,所述超高乙酰度為≥95%;
3.根據權利要求2所述的提取方法,其特征在于,所述殼聚糖衍生物包括:殼聚糖鹽、羧甲基殼聚糖、羥丙基殼聚糖、季銨化殼聚糖、硫基殼聚糖中的至少一種;
4.根據權利要求1~3任一項所述的提取方法,其特征在于,所述選擇性沉淀劑還包括:助沉劑、核酸穩定劑和緩沖液中的至少一種;
5.根據權利要求4所述的提取方法,其特征在于,所述選擇性沉淀劑包括:0.1%~1%w/v殼聚糖、0.1%~5%w/v硅藻土、0.1~1?mm?edta、0.1~2?m?海藻糖和緩沖液;
6.?根據權利要求1所述的提取方法,其特征在于,所述進行沉淀的時間為1~10?min;
7.根據權利要求1所述的提取方法,其特征在于,所述對所述上清液中的核酸進行捕獲或純化的方法包括:磁珠法和/或離心柱法。
8.根據權利要求7所述的提取方法,其特征在于,所述離心柱法采用硅膠膜吸附柱進行;
9.根據權利要求1~3任一項所述的提取方法,其特征在于,所述待測樣本包括陰道拭子樣本;
10.一種選擇性沉淀劑,其特征在于,其包括:權利要求4或5所述的選擇性沉淀劑。