甘磷酸膽堿中雜質(zhì)的檢測(cè)方法

甘磷酸膽堿中雜質(zhì)的檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明以摩爾濃度為0.0005～0.002mol/L的甲酸銨溶液和乙腈的混合溶液作為流動(dòng)相A，以摩爾濃度為0.03～0.05mol/L的甲酸銨溶液和乙腈的混合溶液作為流動(dòng)相B，采用二元梯度洗脫程序，對(duì)甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液進(jìn)行第一液相色譜檢測(cè)，得到雜質(zhì)甘油、氯化膽堿和甘油磷脂酰肌醇的含量；采用乙腈和水做為流動(dòng)相，對(duì)甘磷酸膽堿待測(cè)樣品進(jìn)行第二液相色譜檢測(cè)，得到雜質(zhì)甘油磷脂酰乙醇胺的含量。本發(fā)明提供的檢測(cè)方法可針對(duì)不同的雜質(zhì)建立了不同的色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，從而得到全部已知雜質(zhì)的含量，避免了僅測(cè)定部分雜質(zhì)就判斷甘磷酸膽堿質(zhì)量的片面性，實(shí)現(xiàn)了全面、有效的監(jiān)控甘磷酸膽堿質(zhì)量的目的。
【專利說(shuō)明】甘磷酸膽堿中雜質(zhì)的檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于藥物分析領(lǐng)域，尤其涉及甘磷酸膽堿中雜質(zhì)的檢測(cè)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 老年癡呆癥是一種漸進(jìn)性神經(jīng)退化性失調(diào)癥，其主要表現(xiàn)為記憶功能衰減及識(shí)別 能力障礙，同時(shí)伴有各種神經(jīng)癥狀和行為障礙。研究發(fā)現(xiàn)，我國(guó)老年癡呆癥發(fā)病率居高不 下，其中65歲老人中明顯癡呆者占2%?5%，而85歲以上的老人中幾乎一半患有不同程 度的老年癡呆癥。隨著世界人口老齡化速度的加快，老年癡呆癥已成為危及老年人生命的 第四大病因，嚴(yán)重影響了老年人的身體健康和生活質(zhì)量。因此，抗癡呆癥藥物的研究與開發(fā) 引起了世界各國(guó)醫(yī)藥界的高度重視。
[0003] 研究表明，老年癡呆癥的發(fā)病機(jī)制與神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿的缺乏密切相關(guān)，如果能 夠提高腦內(nèi)乙酰膽堿的水平，就可以改善老年癡呆的癥狀。甘磷酸膽堿能夠穿過血腦屏障， 為乙酰膽堿的合成提供必要的膽堿源，促使乙酰膽堿的合成，增加了腦內(nèi)神經(jīng)突觸間的乙 酰膽堿的含量，從而將海馬區(qū)、腦皮質(zhì)和杏仁體與基底前腦區(qū)相聯(lián)系，延長(zhǎng)膽堿能受體的作 用，達(dá)到治療老年癡呆癥的目的。甘磷酸膽堿在治療老年癡呆癥方面療效顯著，副作用少， 并且具有良好的耐受性和安全性，是一種非常具有市場(chǎng)前景的藥物。
[0004] 但是，甘磷酸膽堿在生產(chǎn)及儲(chǔ)存的過程中，由于不同的工藝因素和環(huán)境因素（如 溫度、氧化和光照等）的影響，有可能會(huì)產(chǎn)生一些雜質(zhì)，會(huì)直接影響藥品的質(zhì)量，所以，需要 一種分析方法，能夠?qū)Ω柿姿崮憠A中各種雜質(zhì)的種類及含量進(jìn)行檢測(cè)，從而達(dá)到控制甘磷 酸膽堿質(zhì)量的目的。目前還沒有能夠有效檢測(cè)甘磷酸膽堿中雜質(zhì)的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的在于提供甘磷酸膽堿中雜質(zhì)的檢測(cè)方法，本發(fā)明提供的甘磷酸膽堿中 雜質(zhì)的檢測(cè)方法能夠有效檢測(cè)出甘磷酸膽堿中的雜質(zhì)及其含量，實(shí)現(xiàn)控制甘磷酸膽堿質(zhì)量 的目的。
[0006] 本發(fā)明提供甘磷酸膽堿中雜質(zhì)的檢測(cè)方法，包括以下步驟：
[0007] 將甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液進(jìn)行第一液相色譜檢測(cè)，得到甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶 液的第一液相色譜圖；
[0008] 所述第一液相色譜檢測(cè)的流動(dòng)相包括流動(dòng)相A和流動(dòng)相B;所述流動(dòng)相A包括第 一甲酸銨溶液和乙腈，所述第一甲酸銨溶液的摩爾濃度為〇. 0005?0. 002mol/L，所述第一 甲酸銨溶液和乙腈的體積比為（1?10) : (99?90);
[0009] 所述流動(dòng)相B包括第二甲酸銨溶液和乙腈，所述第二甲酸銨溶液的摩爾濃度為 0? 03?0? 05mol/L，所述第二甲酸銨溶液和乙腈的體積比為（35?45) : (65?55);
[0010] 根據(jù)所述第一液相色譜圖與預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的第一標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到甘磷酸膽 堿待測(cè)樣品中第一雜質(zhì)的含量，所述第一雜質(zhì)包括甘油、氯化膽堿和甘油磷脂酰肌醇；
[0011] 將甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液進(jìn)行第二液相色譜檢測(cè)，得到甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶 液的第二液相色譜圖，所述第二液相色譜的流動(dòng)相包括乙腈和水，所述乙腈和水的體積比 為（72 ?78) : (28 ?22);
[0012] 根據(jù)所述第二液相色譜圖與預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的第二標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到甘磷酸膽 堿待測(cè)樣品中第二雜質(zhì)的含量，所述第二雜質(zhì)包括甘油磷脂酰乙醇胺。
[0013] 優(yōu)選的，所述第一液相色譜檢測(cè)中的色譜柱為陽(yáng)離子交換柱；
[0014] 所述第一液相色譜檢測(cè)色譜柱的柱溫為20?30°C;
[0015] 優(yōu)選的，所述第一液相色譜檢測(cè)中流動(dòng)相A的流速為0. 95?1. 05mL/min;
[0016] 所述流動(dòng)相B的流速為0? 95?1. 05mL/min。
[0017] 優(yōu)選的，所述第一液相色譜檢測(cè)采用梯度洗脫程序；
[0018] 所述梯度洗脫程序?yàn)椋?br>[0019] 在< 35min內(nèi)，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為（93?97) : (7?3);
[0020] 在彡35且< 65min內(nèi)，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為（45?55) : (55?45);
[0021] 在彡65且< 70min內(nèi)，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為（35?44) : (65?56);
[0022] 在彡70且< 120min內(nèi)，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為（0?5) : (100?95)。
[0023] 優(yōu)選的，所述流動(dòng)相A的pH值為2. 0?4. 0 ;
[0024] 所述流動(dòng)相B的pH值為4. 0?6. 0。
[0025] 優(yōu)選的，所述第二液相色譜檢測(cè)中流動(dòng)相的流速為0. 95?1. 05mL/min。
[0026] 優(yōu)選的，所述第二液相色譜檢測(cè)中流動(dòng)相的pH值為2. 0?4. 0。
[0027] 優(yōu)選的，所述第二液相色譜檢測(cè)中的色譜柱為氨基鍵合硅膠色譜柱；
[0028] 所述第二液相色譜檢測(cè)中色譜柱的柱溫為20?40°C。
[0029] 優(yōu)選的，所述第一液相色譜檢測(cè)的檢測(cè)器為蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；
[0030] 所述第一液相色譜檢測(cè)中蒸發(fā)光散射檢測(cè)器的噴霧器溫度為70?90°C;
[0031] 所述第一液相色譜檢測(cè)中蒸發(fā)光散射檢測(cè)器的載氣壓力為〇? 1?〇? 2MPa。
[0032] 優(yōu)選的，所述第二液相色譜檢測(cè)的檢測(cè)器為蒸發(fā)光散射檢測(cè)器；
[0033] 所述第二液相色譜檢測(cè)中蒸發(fā)光散射檢測(cè)器的噴霧器溫度為70?90°C;
[0034] 所述第二液相色譜檢測(cè)中蒸發(fā)光散射檢測(cè)器的載氣壓力為0? 1?0? 2MPa。
[0035] 本發(fā)明以摩爾濃度為0. 0005?0. 002mol/L的甲酸銨溶液和乙腈的混合溶液作為 流動(dòng)相A，以摩爾濃度為0. 03?0. 05mol/L的甲酸銨溶液和乙腈的混合溶液作為流動(dòng)相B， 采用二元梯度洗脫程序，對(duì)甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液進(jìn)行第一液相色譜檢測(cè)，得到甘磷酸 膽堿中甘油、氯化膽堿和甘油磷脂酰肌醇的含量；采用乙腈和水做為流動(dòng)相，對(duì)甘磷酸膽堿 待測(cè)樣品溶液進(jìn)行第二液相色譜檢測(cè)，得到甘磷酸膽堿中甘油磷脂酰乙醇胺的含量。本發(fā) 明提供的檢測(cè)方法可針對(duì)不同的雜質(zhì)建立了不同的色譜條件進(jìn)行檢測(cè)，從而得到全部已知 雜質(zhì)的含量，避免了僅測(cè)定部分雜質(zhì)就判斷甘磷酸膽堿質(zhì)量的片面性，實(shí)現(xiàn)了全面、有效的 監(jiān)控甘磷酸膽堿質(zhì)量的目的，同時(shí)，也提高了甘磷酸膽堿的質(zhì)量監(jiān)控標(biāo)準(zhǔn)。
[0036] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本發(fā)明提供的檢測(cè)方法能夠有效檢測(cè)出全部已知雜質(zhì)的含量，并 且經(jīng)過多次檢測(cè)后，同一物質(zhì)的保留時(shí)間基本不變，說(shuō)明本發(fā)明提供的檢測(cè)方法具有良好 的可重復(fù)性和穩(wěn)定性。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0037] 圖1為本發(fā)明實(shí)施例1得到的甘磷酸膽堿混合溶液第一液相色譜圖；
[0038] 圖2為本發(fā)明實(shí)施例2得到的甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液的第一液相色譜圖；
[0039] 圖3為本發(fā)明實(shí)施例3得到的甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液的第一液相色譜圖；
[0040]圖4為本發(fā)明實(shí)施例4得到的輔料樣品溶液的第一液相色譜圖；
[0041] 圖5為本發(fā)明實(shí)施例5得到的甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液的第一液相色譜圖；
[0042]圖6為本發(fā)明實(shí)施例6得到的輔料樣品溶液的第一液相色譜圖；
[0043] 圖7為本發(fā)明實(shí)施例7得到的甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液的第一液相色譜圖；
[0044]圖8為本發(fā)明實(shí)施例8得到的輔料樣品溶液的第一液相色譜圖；
[0045] 圖9為本發(fā)明實(shí)施例9得到的甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液的第一液相色譜圖；
[0046]圖10為本發(fā)明實(shí)施例10得到的輔料樣品溶液的第一液相色譜圖；
[0047] 圖11為本發(fā)明實(shí)施例11得到的甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液的第一液相色譜圖；
[0048]圖12為本發(fā)明實(shí)施例12得到的輔料樣品溶液的第一液相色譜圖；
[0049] 圖13為本發(fā)明實(shí)施例13得到的信噪比為3:1的甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液第一次 進(jìn)樣的第一液相色譜圖；
[0050] 圖14為本發(fā)明實(shí)施例13得到的信噪比為3:1的甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液第二次 進(jìn)樣的第一液相色譜圖；
[0051] 圖15為本發(fā)明實(shí)施例13得到的信噪比為3:1的甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液第三次 進(jìn)樣的第一液相色譜圖；
[0052] 圖16為本發(fā)明實(shí)施例14得到的甘磷酸膽堿混合溶液在柱溫20°C下的第一液相色 譜圖；
[0053] 圖17為本發(fā)明實(shí)施例15得到的甘磷酸膽堿混合溶液在柱溫25°C下的第一液相色 譜圖；
[0054] 圖18為本發(fā)明實(shí)施例16得到的甘磷酸膽堿混合溶液在柱溫30°C下的第一液相色 譜圖；
[0055] 圖19為本發(fā)明實(shí)施例17得到的甘磷酸膽堿混合溶液在流動(dòng)相A和流動(dòng)相B的流 速為0. 95mL/min時(shí)的第一液相色譜圖；
[0056] 圖20為本發(fā)明實(shí)施例18得到的甘磷酸膽堿混合溶液在流動(dòng)相A和流動(dòng)相B的流 速為1. 05mL/min時(shí)的第一液相色譜圖；
[0057] 圖21為本發(fā)明實(shí)施例19得到的放置0小時(shí)后的甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液的第一 液相色譜圖；
[0058] 圖22為本發(fā)明實(shí)施例20得到的放置2小時(shí)后甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液的第一液 相色譜圖；
[0059] 圖23為本發(fā)明實(shí)施例21得到的放置4小時(shí)后的甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液的第一 液相色譜圖；
[0060] 圖24為本發(fā)明實(shí)施例22得到的放置8小時(shí)后的甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液的第一 液相色譜圖；
[0061] 圖25為本發(fā)明實(shí)施例23得到的甘磷酸膽堿標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的第二標(biāo)準(zhǔn)液相色譜 圖；
[0062] 圖26為本發(fā)明實(shí)施例24得到的氯化膽堿標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的第二標(biāo)準(zhǔn)液相色譜圖；
[0063] 圖27為本發(fā)明實(shí)施例25得到的甘油磷脂酰肌醇標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的第二標(biāo)準(zhǔn)液相色 譜圖；
[0064]圖28為本發(fā)明實(shí)施例26得到的甘油磷脂酰乙醇胺標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的第二標(biāo)準(zhǔn)液相 色譜圖；
[0065]圖29為本發(fā)明實(shí)施例27得到的輔料標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的第二標(biāo)準(zhǔn)液相色譜圖； [0066] 圖30為本發(fā)明實(shí)施例28得到的甘磷酸膽堿混合溶液a的第二液相色譜圖； [0067]圖31為本發(fā)明實(shí)施例29得到的空白溶劑的第二液相色譜圖；
[0068]圖32為本發(fā)明實(shí)施例30得到的甘油磷脂酰乙醇胺標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的第二液相色譜 圖；
[0069]圖33為本發(fā)明比較例1得到的甘磷酸膽堿混合溶液的第二液相色譜圖；
[0070] 圖34為本發(fā)明比較例2得到的甘磷酸膽堿混合溶液的第二液相色譜圖；
[0071] 圖35為本發(fā)明比較例3得到的甘磷酸膽堿混合溶液的第二液相色譜圖；
[0072] 圖36為本發(fā)明比較例4得到的甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液的第二液相色譜圖；
[0073] 圖37為本發(fā)明比較例5得到的氯化膽堿樣品溶液的第二液相色譜圖；
[0074] 圖38為本發(fā)明比較例6得到的甘油磷脂酰肌醇樣品溶液的第二液相色譜圖；
[0075] 圖39為本發(fā)明比較例7得到的甘油磷脂酰乙醇胺樣品溶液的第二液相色譜圖；
[0076] 圖40為本發(fā)明比較例8得到的輔料樣品溶液的第二液相色譜圖；
[0077] 圖41為本發(fā)明比較例9得到的甘磷酸膽堿混和樣品溶液的第二液相色譜圖；
[0078] 圖42為本發(fā)明實(shí)施例31得到的放置0小時(shí)后甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液的第二液 相色譜圖；
[0079] 圖43為本發(fā)明實(shí)施例32得到的放置2小時(shí)后甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液的第二液 相色譜圖；
[0080] 圖44為本發(fā)明實(shí)施例33得到的放置4小時(shí)后的甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液的第二 液相色譜圖；
[0081] 圖45為本發(fā)明實(shí)施例34得到的放置6小時(shí)后的甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液的第二 液相色譜圖；
[0082] 圖46為本發(fā)明實(shí)施例35得到的放置8小時(shí)后的甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液的第二 液相色譜圖；
[0083] 圖47為本發(fā)明實(shí)施例36得到的放置12小時(shí)后的甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液的第 二液相色譜圖；
[0084] 圖48為本發(fā)明實(shí)施例37得到的空白溶劑的第二液相色譜圖；
[0085]圖49為本發(fā)明實(shí)施例38得到的輔料樣品溶液的第二液相色譜圖；
[0086] 圖50為本發(fā)明實(shí)施例39得到的空白溶劑的第一液相色譜圖；
[0087] 圖51為本發(fā)明實(shí)施例40得到的甘磷酸膽堿對(duì)照溶液a的第一液相色譜圖；
[0088] 圖52為本發(fā)明實(shí)施例40得到的甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液a的第一液相色譜圖；
[0089] 圖53為本發(fā)明實(shí)施例40得到的甘磷酸膽堿對(duì)照溶液a的第二液相色譜圖； [0090]圖54為本發(fā)明實(shí)施例40得到的甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液a的第二液相色譜圖； [0091]圖55為本發(fā)明實(shí)施例41得到的甘磷酸膽堿對(duì)照溶液b的第一液相色譜圖；
[0092]圖56為本發(fā)明實(shí)施例41得到的甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液b的第一液相色譜圖；
[0093] 圖57為本發(fā)明實(shí)施例41得到的甘磷酸膽堿對(duì)照溶液b的第二液相色譜圖；
[0094] 圖58為本發(fā)明實(shí)施例41得到的甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液b的第二液相色譜圖；
[0095] 圖59為本發(fā)明實(shí)施例42得到的甘磷酸膽堿對(duì)照溶液c的第一液相色譜圖；
[0096] 圖60為本發(fā)明實(shí)施例42得到的甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液c的第一液相色譜圖；
[0097] 圖61為本發(fā)明實(shí)施例42得到的甘磷酸膽堿對(duì)照溶液c的第二液相色譜圖；
[0098] 圖62為本發(fā)明實(shí)施例42得到的甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液c的第二液相色譜圖； [0099]圖63為本發(fā)明實(shí)施例43得到的市售甘磷酸膽堿對(duì)照溶液的第一液相色譜圖； [0100]圖64為本發(fā)明實(shí)施例43得到的市售甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液的第一液相色譜圖
[0101] 圖65為本發(fā)明實(shí)施例43得到的市售甘磷酸膽堿對(duì)照溶液的第二液相色譜圖；
[0102] 圖66為本發(fā)明實(shí)施例43得到的市售甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液的第二液相色譜 圖。

【具體實(shí)施方式】
[0103] 本發(fā)明提供了甘磷酸膽堿中雜質(zhì)的檢測(cè)方法，包括以下步驟：
[0104] 將甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液進(jìn)行第一液相色譜檢測(cè)，得到甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶 液的第一液相色譜圖；
[0105] 所述第一液相色譜檢測(cè)的流動(dòng)相包括流動(dòng)相A和流動(dòng)相B;所述流動(dòng)相A包括第 一甲酸銨溶液和乙腈，所述第一甲酸銨溶液的摩爾濃度為〇. 0005?0. 002mol/L，所述第一 甲酸銨溶液和乙腈的體積比為（1?10) : (99?90);
[0106] 所述流動(dòng)相B包括第二甲酸銨溶液和乙腈，所述第二甲酸銨溶液的摩爾濃度為 0? 03?0? 05mol/L，所述第二甲酸銨溶液和乙腈的體積比為（35?45) : (65?55);
[0107] 根據(jù)所述第一液相色譜圖與預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的第一標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到甘磷酸膽 堿待測(cè)樣品中第一雜質(zhì)的含量，所述第一雜質(zhì)包括甘油、氯化膽堿和甘油磷脂酰肌醇；
[0108] 將甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液進(jìn)行第二液相色譜檢測(cè)，得到甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶 液的第二液相色譜圖，所述第二液相色譜的流動(dòng)相包括乙腈和水，所述乙腈和水的體積比 為（72 ?78):(28 ?22);
[0109] 根據(jù)所述第二液相色譜圖與預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的第二標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到甘磷酸膽 堿待測(cè)樣品中第二雜質(zhì)的含量，所述第二雜質(zhì)包括甘油磷脂酰乙醇胺。
[0110] 本發(fā)明將甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液進(jìn)行第一液相色譜檢測(cè)，得到甘磷酸膽堿待測(cè) 樣品溶液的第一液相色譜圖。本發(fā)明優(yōu)選將甘磷酸膽堿待測(cè)樣品與水混合，得到甘磷酸膽 堿待測(cè)樣品溶液。在本發(fā)明中，所述甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液的質(zhì)量濃度優(yōu)選為40?60g/ L，更優(yōu)選為50g/L。
[0111] 所述第一液相色譜檢測(cè)的進(jìn)樣量?jī)?yōu)選為15?25yL，更優(yōu)選為17?23yL，最優(yōu) 選為20uL。
[0112] 在本發(fā)明中，所述第一液相色譜檢測(cè)的色譜柱優(yōu)選為陽(yáng)離子交換柱，所述色譜柱 的填料優(yōu)選為硅膠，具體的，可以使用資生堂CAPCELLPAKSCX液相色譜柱；所述第一液相 色譜檢測(cè)的色譜柱柱溫優(yōu)選為20?30°C，更優(yōu)選為22?37°C，最優(yōu)選為25°C;
[0113] 在本發(fā)明中，所述第一液相色譜檢測(cè)的流動(dòng)相包括流動(dòng)相A和流動(dòng)相B。在本發(fā) 明中，所述流動(dòng)相A包括第一甲酸銨溶液和乙腈，所述第一甲酸銨溶液的濃度為0. 0005? 0. 002mol/L，優(yōu)選為0. 0008?0. 0015mol/L，更優(yōu)選為0.OOlmol/L;所述第一甲酸銨溶液和 乙腈的體積比為（1?10) : (99?90)，優(yōu)選為（1?5) : (99?95)，更優(yōu)選為1 :99 ;所述流 動(dòng)相A的pH值優(yōu)選為2. 0?4. 0,更優(yōu)選為2. 5?3. 5,最優(yōu)選為3. 0 ;本發(fā)明優(yōu)選采用酸 性介質(zhì)對(duì)所述流動(dòng)相A的pH值進(jìn)行調(diào)節(jié)，所述酸性介質(zhì)優(yōu)選為甲酸；本發(fā)明優(yōu)選采用酸性 溶液作為酸性介質(zhì)，本發(fā)明對(duì)所述酸性溶液的濃度和用量沒有特殊的限制，能夠?qū)⑺隽?動(dòng)相A的pH值調(diào)節(jié)至上述范圍即可。
[0114] 在本發(fā)明中，所述流動(dòng)相A的流速優(yōu)選為0. 95?1. 05mL/min，更優(yōu)選為0. 98? L02mL/min,最優(yōu)選為lmL/min〇
[0115] 在本發(fā)明中，所述流動(dòng)相B包括第二甲酸銨溶液和乙腈，所述第二甲酸銨溶液的 濃度為〇. 03?0. 05mol/L，優(yōu)選為0. 035?0. 045mol/L，更優(yōu)選為0. 04mol/L;所述第二 甲酸銨溶液和乙腈的體積比為（35?45) : (65?55)，優(yōu)選為（38?43) : (62?57)，更優(yōu) 選為40 :60 ;所述流動(dòng)相B的pH值優(yōu)選為4. 0?6. 0,更優(yōu)選為4. 5?5. 5,最優(yōu)選為5. 0 ; 本發(fā)明優(yōu)選采用酸性介質(zhì)對(duì)所述流動(dòng)相B的pH值進(jìn)行調(diào)節(jié)，所述酸性介質(zhì)優(yōu)選為甲酸；本 發(fā)明優(yōu)選采用酸性溶液作為酸性介質(zhì)，本發(fā)明對(duì)所述酸性溶液的濃度和用量沒有特殊的限 制，能夠?qū)⑺隽鲃?dòng)相B的pH值調(diào)節(jié)至上述范圍即可。
[0116] 在本發(fā)明中，所述流動(dòng)相B的流速優(yōu)選為0. 95?1. 05mL/min，更優(yōu)選為0. 98? L02mL/min,最優(yōu)選為lmL/min〇
[0117] 在本發(fā)明中，所述第一液相色譜檢測(cè)優(yōu)選采用梯度洗脫程序，所述梯度洗脫程序 優(yōu)選為：
[0118] 在< 35min內(nèi)，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為（93?97):(7?3);
[0119] 在彡35且< 65min內(nèi)，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為（45?55):(55?45);
[0120] 在彡65且< 70min內(nèi)，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為（35?44) : (65?56);
[0121] 在彡70且< 120min內(nèi)，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為（0?5) : (100?95)。
[0122] 更優(yōu)選為：
[0123] 在< 35min內(nèi)，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為（94?96):(6?4);
[0124] 在彡35且< 65min內(nèi)，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為（47?53):(53?47);
[0125] 在彡65且< 70min內(nèi)，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為（47?53):(53?47);
[0126] 在彡70且< 120min內(nèi)，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為（0?3) : (100?97);
[0127] 最優(yōu)選為：
[0128] 在< 35min內(nèi)，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為95 :5;
[0129] 在彡35且< 65min內(nèi)，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為50 :50;
[0130] 在彡65且< 70min內(nèi)，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為40 :60;
[0131] 在彡70且< 120min內(nèi)，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為0 :100。
[0132] 所述第一液相色譜檢測(cè)的檢測(cè)器優(yōu)選為蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，所述第一液相色譜檢 測(cè)中蒸發(fā)光散射檢測(cè)器的漂移管溫度優(yōu)選為60?100°C，更優(yōu)選為70?90°C，最優(yōu)選為 80°C;所述第一液相色譜檢測(cè)中蒸發(fā)光散射檢測(cè)器優(yōu)選氮?dú)庾鳛殪F化氣；所述霧化氣的壓 力優(yōu)選為〇. 1?〇. 2MPa，更優(yōu)選為0. 13?0. 18MPa，最優(yōu)選為0. 15MPa;所述霧化氣的流速 優(yōu)選為2?3L/min，更優(yōu)選為2. 5L/min;所述第一液相色譜檢測(cè)中蒸發(fā)光散射檢測(cè)器的噴 霧器溫度優(yōu)選為70?90°C，更優(yōu)選為80°C;。
[0133] 得到甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液的第一液相色譜圖后，本發(fā)明根據(jù)所述甘磷酸膽堿 待測(cè)樣品溶液的第一液相色譜圖與預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的第一標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到甘磷酸膽堿 待測(cè)樣品中第一雜質(zhì)的含量，所述第一雜質(zhì)包括甘油、氯化膽堿和甘油磷脂酰肌醇。本發(fā)明 優(yōu)選對(duì)所述第一雜質(zhì)進(jìn)行定量檢測(cè)前，對(duì)所述甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液第一液相色譜圖中 的色譜峰進(jìn)行定性，即對(duì)出峰位置進(jìn)行定位；
[0134] 本發(fā)明優(yōu)選將所述第一雜質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液進(jìn)行第一液相色譜檢測(cè)，得到第一雜 質(zhì)的第一液相色譜圖，將所述第一雜質(zhì)的第一液相色譜圖中色譜峰的保留時(shí)間與所述甘磷 酸膽堿待測(cè)樣品溶液第一液相色譜圖中色譜峰的保留時(shí)間進(jìn)行比對(duì)，實(shí)現(xiàn)所述甘磷酸膽堿 待測(cè)樣品溶液第一液相色譜圖中色譜峰的定性。
[0135] 在本發(fā)明中，所述第一標(biāo)準(zhǔn)曲線為第一雜質(zhì)的質(zhì)量濃度與其對(duì)應(yīng)的色譜峰面積之 間的線性曲線，所述第一標(biāo)準(zhǔn)曲線優(yōu)選按照以下方法獲得：
[0136] 配制系列濃度的第一標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，所述第一標(biāo)準(zhǔn)樣品為第一雜質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)樣品；
[0137] 將所述系列濃度的第一標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液進(jìn)行第一液相色譜檢測(cè)，得到系列的第一標(biāo) 準(zhǔn)液相色譜圖；
[0138] 將所述系列的第一標(biāo)準(zhǔn)液相色譜圖中第一雜質(zhì)的色譜峰面積與其對(duì)應(yīng)的第一雜 質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度進(jìn)行線性擬合，得到第一標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0139] 在本發(fā)明中，所述第一標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液包括甘油標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液、氯化膽堿標(biāo)準(zhǔn)樣品 溶液和甘油磷脂酰肌醇標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液。在本發(fā)明中，所述第一標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液可以是各組分 獨(dú)立的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，也可以是各組分的混合標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液。本發(fā)明優(yōu)選將甘油的純品溶 于水，配制得到系列濃度的甘油標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液。本發(fā)明對(duì)所述甘油純品的來(lái)源沒有特殊的 限制，采用甘油純品的市售商品即可。在本發(fā)明中，所述甘油標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的質(zhì)量濃度優(yōu)選 為1?5mg/mL，更優(yōu)選為2?4mg/mL，最優(yōu)選為3mg/mL。
[0140] 得到所述系列濃度的甘油標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液后，本發(fā)明優(yōu)選將得到的系列濃度的甘油 標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液進(jìn)行第一液相色譜檢測(cè)，得到甘油標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的系列第一標(biāo)準(zhǔn)液相色譜 圖。
[0141] 得到所述甘油標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的系列第一標(biāo)準(zhǔn)液相色譜圖后，本發(fā)明優(yōu)選以所述甘 油標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的系列第一標(biāo)準(zhǔn)液相色譜圖中的峰面積為縱坐標(biāo)，以其對(duì)應(yīng)的甘油標(biāo)準(zhǔn)樣 品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，得到峰面積和質(zhì)量濃度的曲線，將所述曲線進(jìn)行線性擬合，得 到甘油標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的第一標(biāo)準(zhǔn)曲線。在本發(fā)明中，所述峰面積優(yōu)選采用積分得到，本發(fā)明 對(duì)所述積分的方法沒有特殊的限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的計(jì)分方法即可。本發(fā)明對(duì) 所述線性擬合的方法沒有特殊的限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的線性擬合的方法即可。
[0142] 本發(fā)明優(yōu)選按照上述技術(shù)方案，得到所述第一標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液中除甘油外的其他已 知雜質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的第一標(biāo)準(zhǔn)曲線，包括氯化膽堿標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的第一標(biāo)準(zhǔn)曲線和甘 油磷脂酰肌醇標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的第一標(biāo)準(zhǔn)曲線，不同的是，在本發(fā)明中，所述氯化膽堿標(biāo)準(zhǔn)樣 品溶液的質(zhì)量濃度優(yōu)選為〇. 05?0. 45g/L，所述甘油磷脂酰肌醇標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的質(zhì)量濃度 優(yōu)選為〇? 05?0? 45g/L。
[0143] 得到所述第一標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的第一標(biāo)準(zhǔn)曲線后，本發(fā)明根據(jù)所述第一標(biāo)準(zhǔn)曲線， 得到所述甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液中第一雜質(zhì)的質(zhì)量濃度；根據(jù)所述甘磷酸膽堿待測(cè)樣品 的質(zhì)量、所述甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液的質(zhì)量、與所述甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液中第一雜 質(zhì)的質(zhì)量濃度，得到所述甘磷酸膽堿待測(cè)樣品中第一雜質(zhì)的含量，所述第一雜質(zhì)包括甘油。 氯化膽堿和甘油磷脂酰肌醇。
[0144] 除了已知的甘油、氯化膽堿和甘油磷脂酰肌醇以外，所述第一雜質(zhì)中優(yōu)選還包括 未知雜質(zhì)。所述未知雜質(zhì)包括在酸、堿和光照等條件下產(chǎn)生的雜質(zhì)。本發(fā)明優(yōu)選將所述甘 磷酸膽堿樣品進(jìn)行第一主成分自身對(duì)照檢測(cè)，以得到所述甘磷酸膽堿樣品中未知雜質(zhì)的含 量，包括以下步驟：
[0145] 1)提供甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液和甘磷酸膽堿對(duì)照溶液；
[0146] 2)將所述步驟1)中的甘磷酸膽堿對(duì)照溶液注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)色譜儀靈敏度；
[0147] 3)將所述步驟1)中的甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液和甘磷酸膽堿對(duì)照溶液分別進(jìn)行 第一液相色譜檢測(cè)，得到所述甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液的第一液相色譜圖和甘磷酸膽堿對(duì) 照溶液的第一液相色譜圖；
[0148] 4)根據(jù)所述甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液的第一液相色譜圖和甘磷酸膽堿對(duì)照溶液 的第一液相色譜圖，得到甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液中未知雜質(zhì)的含量。
[0149] 在本發(fā)明中，所述甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液的來(lái)源與質(zhì)量濃度與上述技術(shù)方案中 甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液的來(lái)源和質(zhì)量濃度一致，在此不再贅述。本發(fā)明優(yōu)選將所述甘磷 酸膽堿待測(cè)樣品溶液進(jìn)行稀釋，得到甘磷酸膽堿對(duì)照溶液。在本發(fā)明中，所述甘磷酸膽堿對(duì) 照溶液與所述甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液的質(zhì)量濃度之比優(yōu)選為1 :1〇〇。
[0150] 得到所述甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液和甘磷酸膽堿對(duì)照溶液后，本發(fā)明將所述甘磷 酸膽堿對(duì)照溶液注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)靈敏度，使主成分色譜峰的峰高為滿量程的10? 25 %，優(yōu)選為20%。在本發(fā)明中，所述甘磷酸膽堿對(duì)照溶液的進(jìn)樣量?jī)?yōu)選為20yL。
[0151] 靈敏度調(diào)節(jié)完畢后，本發(fā)明將所述步驟1)中的甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液和甘磷 酸膽堿對(duì)照溶液分別進(jìn)行第一液相色譜檢測(cè)，得到所述甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液的第一液 相色譜圖和甘磷酸膽堿對(duì)照溶液的第一液相色譜圖。在本發(fā)明所述的第一主成分自身對(duì)照 檢測(cè)中，所述甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液的第一液相色譜圖的記錄時(shí)間優(yōu)選為主成分色譜峰 保留時(shí)間的2倍；所述甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液的第一液相色譜圖中如有甘油、甘油磷脂 酰肌醇和氯化膽堿雜質(zhì)峰，其峰面積不得大于所述甘磷酸膽堿對(duì)照溶液的第一液相色譜圖 中主峰面積的一半，即不得大于所述甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液的第一液相色譜圖中主峰面 積的0. 5% ;其他任一雜質(zhì)峰峰面積不得大于所述甘磷酸膽堿對(duì)照溶液的第一液相色譜圖 中主峰面積的1/5,即不得大于所述甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液的第一液相色譜圖中主峰面 積的0. 2% ;各雜質(zhì)峰面積之和不得大于所述甘磷酸膽堿對(duì)照溶液的第一液相色譜圖中主 峰面積的兩倍，即不得大于所述甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液的第一液相色譜圖中主峰面積的 2. 0%。
[0152] 本發(fā)明優(yōu)選按照上述獲得甘油標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的第一標(biāo)準(zhǔn)曲線的技術(shù)方案，得到甘 磷酸膽堿標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的第一標(biāo)準(zhǔn)曲線。本發(fā)明根據(jù)得到的甘磷酸膽堿標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的第 一標(biāo)準(zhǔn)曲線和所述甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液的第一液相色譜圖中甘磷酸膽堿對(duì)應(yīng)的峰面 積，得到所述甘磷酸膽堿待測(cè)樣品中甘磷酸膽堿的含量。
[0153] 得到所述甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液和甘磷酸膽堿對(duì)照溶液的第一液相色譜圖后， 本發(fā)明根據(jù)所述甘磷酸膽堿待測(cè)樣品中甘磷酸膽堿的含量、所述甘磷酸膽堿對(duì)照溶液與所 述甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液的質(zhì)量濃度之比、所述甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液的第一液相色 譜圖中未知雜質(zhì)的峰面積和所述甘磷酸膽堿對(duì)照溶液第一液相色譜圖中甘磷酸膽堿的峰 面積，得到所述甘磷酸膽堿待測(cè)樣品中未知雜質(zhì)的含量。
[0154] 本發(fā)明將甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液進(jìn)行第二液相色譜檢測(cè)，得到甘磷酸膽堿待測(cè) 樣品溶液的第二液相色譜圖。本發(fā)明優(yōu)選將甘磷酸膽堿待測(cè)樣品與水混合，得到甘磷酸膽 堿待測(cè)樣品溶液。在本發(fā)明中，所述甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液的質(zhì)量濃度優(yōu)選為40?60g/ L，更優(yōu)選為50g/L。
[0155] 在本發(fā)明中，所述第二液相色譜檢測(cè)的進(jìn)樣量?jī)?yōu)選為15?25yL，更優(yōu)選為17? 23iiL，最優(yōu)選為20iiL。
[0156] 在本發(fā)明中，所述第二液相色譜檢測(cè)的色譜柱優(yōu)選為氨基鍵合硅膠色譜柱；所述 第二液相色譜檢測(cè)的色譜柱柱溫優(yōu)選為20?40°C，更優(yōu)選為30°C。
[0157] 在本發(fā)明中，所述第二液相色譜檢測(cè)的流動(dòng)相包括乙腈和水，所述乙腈和水的體 積比為（72?78) : (28?22)，優(yōu)選為（73?77) : (27?23)，更優(yōu)選為75 :25 ;所述第二液 相色譜檢測(cè)中流動(dòng)相的pH值優(yōu)選為2. 0?4. 0,更優(yōu)選為2. 5?3. 5,最優(yōu)選為3. 0 ;本發(fā)明 優(yōu)選采用酸性介質(zhì)對(duì)所述第二液相色譜檢測(cè)的流動(dòng)相的pH值進(jìn)行調(diào)節(jié)，所述酸性介質(zhì)優(yōu) 選為冰醋酸；本發(fā)明優(yōu)選采用酸性溶液作為酸性介質(zhì)，本發(fā)明對(duì)所述酸性溶液的濃度和用 量沒有特殊的限制，能夠?qū)⑺龅诙合嗌V檢測(cè)中流動(dòng)相的pH值調(diào)節(jié)至上述范圍即可。
[0158] 在本發(fā)明中，所述第二液相色譜檢測(cè)中流動(dòng)相的流速優(yōu)選為0. 95?1. 05mL/min， 更優(yōu)選為〇. 98?1. 03mL/min，最優(yōu)選為lmL/min。
[0159] 在本發(fā)明中，所述第二液相色譜檢測(cè)的檢測(cè)器優(yōu)選為蒸發(fā)光散射檢測(cè)器，所述第 二液相色譜檢測(cè)中蒸發(fā)光散射檢測(cè)器的漂移管溫度優(yōu)選為60?100°C，更優(yōu)選為70? 90°C，最優(yōu)選為80°C;所述第二液相色譜檢測(cè)中的蒸發(fā)光散射檢測(cè)器優(yōu)選氮?dú)庾鳛殪F化氣； 所述霧化氣的壓力優(yōu)選為〇. 1?〇. 2MPa，更優(yōu)選為0. 13?0. 18MPa，最優(yōu)選為0. 15MPa;所 述霧化氣的流速優(yōu)選為2?3L/min，更優(yōu)選為2. 5L/min;所述第二液相色譜檢測(cè)中蒸發(fā)光 散射檢測(cè)器的噴霧器溫度優(yōu)選為70?90°C，更優(yōu)選為80°C;
[0160] 得到甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液的第二液相色譜圖后，本發(fā)明根據(jù)所述甘磷酸膽堿 待測(cè)樣品溶液的第二液相色譜圖與預(yù)定的第二標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的第二標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到甘磷酸 膽堿待測(cè)樣品溶液中第二雜質(zhì)的含量，所述第二雜質(zhì)包括甘油磷脂酰乙醇胺。本發(fā)明優(yōu)選 對(duì)所述第二雜質(zhì)進(jìn)行定量檢測(cè)前，對(duì)所述甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液第二液相色譜圖中的色 譜峰進(jìn)行定性，即對(duì)出峰位置進(jìn)行定位；
[0161] 本發(fā)明優(yōu)選將所述第二雜質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液進(jìn)行第二液相色譜檢測(cè)，得到第二雜 質(zhì)的第二液相色譜圖，將所述第二雜質(zhì)的第二液相色譜圖中色譜峰的保留時(shí)間與所述甘磷 酸膽堿待測(cè)樣品溶液第二液相色譜圖中色譜峰的保留時(shí)間進(jìn)行比對(duì)，實(shí)現(xiàn)所述甘磷酸膽堿 待測(cè)樣品溶液第二液相色譜圖中色譜峰的定性。
[0162] 在本發(fā)明中，所述第二標(biāo)準(zhǔn)曲線為第二雜質(zhì)的質(zhì)量濃度與其對(duì)應(yīng)的色譜峰面積之 間的線性曲線，所述第二標(biāo)準(zhǔn)曲線優(yōu)選按照以下方法獲得：
[0163] 配制系列濃度的第二標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液，所述第二標(biāo)準(zhǔn)樣品為第二雜質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)樣品；
[0164] 將所述系列濃度的第二標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液進(jìn)行第二液相色譜檢測(cè)，得到第二標(biāo)準(zhǔn)樣品 溶液的系列第二液相色譜圖；
[0165] 將所述第二標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的系列第二標(biāo)準(zhǔn)液相色譜圖中第二雜質(zhì)的色譜峰面積 與其對(duì)應(yīng)的第二雜質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)樣品的濃度進(jìn)行線性擬合，得到第二標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0166] 在本發(fā)明中，所述第二標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液包括甘油磷脂酰乙醇胺標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液。在本 發(fā)明中，所述甘油磷脂酰乙醇胺標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的來(lái)源和質(zhì)量濃度與上述技術(shù)方案中甘油磷 脂酰乙醇胺標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的來(lái)源和質(zhì)量濃度一致，在此不再贅述。
[0167] 得到所述系列濃度的第二標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液后，本發(fā)明優(yōu)選將得到的系列濃度甘油磷 脂酰乙醇胺樣品溶液進(jìn)行第二液相色譜檢測(cè)，得到甘油磷脂酰乙醇胺樣品溶液的系列第二 標(biāo)準(zhǔn)液相色譜圖。
[0168] 得到所述甘油磷脂酰乙醇胺的系列第二標(biāo)準(zhǔn)液相色譜圖后，本發(fā)明優(yōu)選以所述甘 油磷脂酰乙醇胺標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的系列第二標(biāo)準(zhǔn)液相色譜圖中的峰面積為縱坐標(biāo)，以其對(duì)應(yīng) 的甘油磷脂酰乙醇胺標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，得到峰面積和質(zhì)量濃度的曲線， 將所述曲線進(jìn)行線性擬合，得到甘油磷脂酰乙醇胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在本發(fā)明中，所述峰面積優(yōu) 選采用積分得到，本發(fā)明對(duì)所述積分的方法沒有特殊的限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的 計(jì)分方法即可。本發(fā)明對(duì)所述線性擬合的方法沒有特殊的限制，采用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知 的線性擬合的方法即可。
[0169] 得到所述甘油磷脂酰乙醇胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線后，本發(fā)明根據(jù)所述甘磷酸膽堿待測(cè)樣品 溶液的第二液相色譜圖與所述甘油磷脂酰乙醇胺的標(biāo)準(zhǔn)曲線可得到所述甘磷酸膽堿待測(cè) 樣品溶液中甘油磷脂酰乙醇胺的質(zhì)量濃度；根據(jù)所述甘磷酸膽堿待測(cè)樣品的質(zhì)量、所述甘 磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液的質(zhì)量與所述甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液中甘油磷脂酰乙醇胺的質(zhì) 量濃度，得到所述甘磷酸膽堿待測(cè)樣品中第二雜質(zhì)的含量，所述第二雜質(zhì)包括甘油磷脂酰 乙醇胺。
[0170] 除了已知雜質(zhì)甘油磷脂酰乙醇胺外，所述第二雜質(zhì)還包括未知雜質(zhì)。所述未知雜 質(zhì)包括在酸、堿和光照等條件下產(chǎn)生的雜質(zhì)。本發(fā)明優(yōu)選將所述甘磷酸膽堿樣品進(jìn)行第二 主成分自身對(duì)照檢測(cè)，以得到所述甘磷酸膽堿樣品中未知雜質(zhì)的含量，包括以下步驟：
[0171] I)提供甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液和甘磷酸膽堿對(duì)照溶液；
[0172] II)將所述步驟I)中的甘磷酸膽堿對(duì)照溶液注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)色譜儀靈敏 度；
[0173] III)將所述步驟I)中的甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液和甘磷酸膽堿對(duì)照溶液分別進(jìn) 行第二液相色譜檢測(cè)，得到所述甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液和甘磷酸膽堿對(duì)照溶液的第二液 相色譜圖；
[0174] IV)根據(jù)所述甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液的第二液相色譜圖和甘磷酸膽堿對(duì)照溶 液的第二液相色譜圖，得到甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液中未知雜質(zhì)的含量。
[0175] 本發(fā)明按照上述技術(shù)方案得到甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液和甘磷酸膽堿對(duì)照溶液， 并按照上述技術(shù)方案將所述甘磷酸膽堿對(duì)照溶液注入液相色譜儀，調(diào)節(jié)靈敏度。
[0176] 靈敏度調(diào)節(jié)完畢后，本發(fā)明將所述步驟I)中的甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液和甘磷 酸膽堿對(duì)照溶液分別進(jìn)行第二液相色譜檢測(cè)，得到所述甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液的第二液 相色譜圖和甘磷酸膽堿對(duì)照溶液的第二液相色譜圖。在所述第二主成分自身對(duì)照檢測(cè)中， 所述甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液的第二液相色譜圖中如有甘油磷脂酰乙醇胺雜質(zhì)峰，其峰 面積不得大于所述甘磷酸膽堿對(duì)照溶液的第二液相色譜圖主峰面積的〇.5倍，即不得大于 所述甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液的第二液相色譜圖主峰面積的〇. 5%。
[0177] 本發(fā)明優(yōu)選按照上述獲得第二標(biāo)準(zhǔn)曲線的技術(shù)方案，得到甘磷酸膽堿標(biāo)準(zhǔn)樣品溶 液的第二標(biāo)準(zhǔn)曲線。本發(fā)明根據(jù)得到的甘磷酸膽堿標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的第二標(biāo)準(zhǔn)曲線和所述甘 磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液的第二液相色譜圖中甘磷酸膽堿對(duì)應(yīng)的峰面積，得到所述甘磷酸膽 堿待測(cè)樣品中甘磷酸膽堿的含量。
[0178] 得到所述甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液和甘磷酸膽堿對(duì)照溶液的第二液相色譜圖后， 本發(fā)明根據(jù)所述甘磷酸膽堿待測(cè)樣品中甘磷酸膽堿的含量、所述甘磷酸膽堿對(duì)照溶液與所 述甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液的質(zhì)量濃度之比、所述甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液的第二液相色 譜圖中未知雜質(zhì)的峰面積和所述甘磷酸膽堿對(duì)照溶液第二液相色譜圖中甘磷酸膽堿的峰 面積，得到所述甘磷酸膽堿待測(cè)樣品中未知雜質(zhì)的含量。
[0179] 本發(fā)明提供的檢測(cè)方法不僅能檢測(cè)出甘磷酸膽堿中已知雜質(zhì)甘油、氯化膽堿、甘 油磷脂酰肌醇和甘油磷脂酰乙醇胺的含量，還能檢測(cè)出在酸、堿和光照等條件下可能產(chǎn)生 的未知雜質(zhì)的含量，避免了僅測(cè)定部分雜質(zhì)就判斷甘磷酸膽堿質(zhì)量的片面性，實(shí)現(xiàn)了全面、 有效的監(jiān)控甘磷酸膽堿質(zhì)量的目的。
[0180] 為了進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的甘磷酸膽堿中雜質(zhì)的檢 測(cè)方法進(jìn)行詳細(xì)描述，但不能將它們理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。
[0181] 在下述實(shí)施例中，所用乙腈購(gòu)自MREDATECHNOLOGYINC公司，純度為色譜純，甲酸 銨購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，純度為分析純，甲酸購(gòu)自北京化工廠，純度為分析純， 乙酸購(gòu)自北京化工廠，純度為分析純。
[0182] 實(shí)施例1
[0183] 將甘磷酸膽堿、氯化膽堿、甘油磷脂酰肌醇、空膠囊殼和甘油與水混合，混合均 勻后進(jìn)行過濾，得到甘磷酸膽堿混合溶液A，每lmL甘磷酸膽堿混合溶液中含甘磷酸膽堿 50mg、氯化膽堿0. 25mg、甘油磷脂酰肌醇0. 25mg、空膠囊殼50mg、甘油3mg。
[0184] 取20L所述甘磷酸膽堿混合溶液A，注入島津液相色譜儀，采用Alltech2000ES 型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)。
[0185] 島津液相色譜儀采用LC-lOATvp型泵，CBM-20A型控制器，CLASS-VP型色譜工作 站；
[0186]Alltech2000ES型蒸發(fā)光散射檢測(cè)器的漂移管溫度為，噴霧器溫度為80°C，霧化 氣為氮?dú)猓F化氣流速為2. 5L/min，載氣壓力為0? 15MPa;
[0187] 色譜條件為：資生堂CAPCELLPAKSCX色譜柱，色譜柱填料顆粒大小5iim，色譜柱 尺寸為4. 6X250mm;采用二元梯度洗脫程序，如表1所示，表1為本發(fā)明實(shí)施例1采用的二 元梯度洗脫程序。流動(dòng)相A為體積比為99:1的乙腈和摩爾濃度為0. 001m〇l/L甲酸銨溶液， 流速為1.OmL/min，用甲酸調(diào)節(jié)pH值為3. 0 ;流動(dòng)相B為體積比為60:40的乙腈和摩爾濃度 為0. 04mol/L甲酸銨溶液，流速為1.OmL/min，用甲酸調(diào)節(jié)pH值為5. 0 ;
[0188] 表1本發(fā)明實(shí)施例1采用的二元梯度洗脫程序
[0189]

【權(quán)利要求】
1. 甘磷酸膽堿中雜質(zhì)的檢測(cè)方法，包括以下步驟：將甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液進(jìn)行第一液相色譜檢測(cè)，得到甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液的 第一液相色譜圖；所述第一液相色譜檢測(cè)的流動(dòng)相包括流動(dòng)相A和流動(dòng)相B ;所述流動(dòng)相A包括第一甲 酸銨溶液和乙腈，所述第一甲酸銨溶液的摩爾濃度為〇. 0005?0. 002mol/L，所述第一甲酸 銨溶液和乙腈的體積比為（1?10) : (99?90);所述流動(dòng)相B包括第二甲酸銨溶液和乙腈，所述第二甲酸銨溶液的摩爾濃度為0. 03?0.05mol/L，所述第二甲酸銨溶液和乙腈的體積比為（35?45) :(65?55);根據(jù)所述第一液相色譜圖與預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的第一標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到甘磷酸膽堿待 測(cè)樣品中第一雜質(zhì)的含量，所述第一雜質(zhì)包括甘油、氯化膽堿和甘油磷脂酰肌醇；將甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液進(jìn)行第二液相色譜檢測(cè)，得到甘磷酸膽堿待測(cè)樣品溶液 的第二液相色譜圖，所述第二液相色譜的流動(dòng)相包括乙腈和水，所述乙腈和水的體積比為 (72 ?78) : (28 ?22);根據(jù)所述第二液相色譜圖與預(yù)定的標(biāo)準(zhǔn)樣品溶液的第二標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到甘磷酸膽堿待 測(cè)樣品中第二雜質(zhì)的含量，所述第二雜質(zhì)包括甘油磷脂酰乙醇胺。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述第一液相色譜檢測(cè)中的色譜柱 為陽(yáng)離子交換柱； 所述第一液相色譜檢測(cè)色譜柱的柱溫為20?30°C。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述第一液相色譜檢測(cè)中流動(dòng)相A的 流速為 〇? 95 ?1. 05mL/min ; 所述流動(dòng)相B的流速為0. 95?1. 05mL/min。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1?3任意一項(xiàng)所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述第一液相色譜檢測(cè) 采用梯度洗脫程序； 所述梯度洗脫程序?yàn)椋涸?lt; 35min內(nèi)，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為（93?97) : (7?3);在彡35且< 65min內(nèi)，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為（45?55) : (55?45);在彡65且< 70min內(nèi)，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為（35?44) : (65?56);在彡70且< 120min內(nèi)，流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的體積比為（0?5) : (100?95)。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述流動(dòng)相A的pH值為2. 0?4. 0 ; 所述流動(dòng)相B的pH值為4. 0?6. 0。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述第二液相色譜檢測(cè)中流動(dòng)相的 流速為 〇? 95 ?1. 05mL/min。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述第二液相色譜檢測(cè)中流動(dòng)相的 pH值為2. 0?4. 0。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述第二液相色譜檢測(cè)中的色譜柱 為氨基鍵合硅膠色譜柱； 所述第二液相色譜檢測(cè)中色譜柱的柱溫為20?40°C。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述第一液相色譜檢測(cè)的檢測(cè)器為 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器； 所述第一液相色譜檢測(cè)中蒸發(fā)光散射檢測(cè)器的噴霧器溫度為70?90°C ;所述第一液相色譜檢測(cè)中蒸發(fā)光散射檢測(cè)器的載氣壓力為〇. 1?〇. 2MPa。
10.根據(jù)權(quán)利要求1所述的檢測(cè)方法，其特征在于，所述第二液相色譜檢測(cè)的檢測(cè)器為 蒸發(fā)光散射檢測(cè)器； 所述第二液相色譜檢測(cè)中蒸發(fā)光散射檢測(cè)器的噴霧器溫度為70?90°C ;所述第二液相色譜檢測(cè)中蒸發(fā)光散射檢測(cè)器的載氣壓力為〇. 1?〇. 2MPa。
【文檔編號(hào)】G01N30/02GK104458942SQ201410698223
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年11月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年11月27日
【發(fā)明者】傅超婷, 云沖, 劉五生, 李錦云, 朱峰, 王玉娟, 李富志 申請(qǐng)人:海南通用三洋藥業(yè)有限公司