本發明涉及生物工程領域，具體涉及一種spycatcher固定化突變體spyfixer及其應用；特別涉及一種spyfixer-spytag連接對在ar2g傳感器、環氧瓊脂糖樹脂、環氧丙烯酸酯樹脂上的固定化應用。
背景技術：
1、蛋白質固定在固相載體表面可以形成特殊的微環境，使蛋白質更好的實現功能[biomacromolecules,2018,19(10):4098-112]。蛋白質固定技術在生物制藥、生物傳感器、固定化酶、免疫學研究、納米材料制備等領域有著廣泛的應用[acs?chemical?biology,2018,13(10):2973-80,environ?sci-nano,2023,10(10):2799-2809,biotechnologyadvances,2018,36(5):1470-1480,small,2022,18(19),blood,2016,128(22),acsapplied?nano?materials,2018,1(8):4053-4063]。然而，傳統的固定化方法往往隨機地靶向蛋白質表面的親核氨基酸(如賴氨酸、半胱氨酸、天冬氨酸等)，容易導致不期望的活性損失[nature?protocols,2007,(2)5,1022-1033，bioconjugate?chemistry,2013,24(11),1761-1777]。為了最大限度地保持蛋白的活性，近年來已經發展了一些能夠實現均一取向進行蛋白定向固定的方法。基于生物親和相互作用系統，如histag系統、protein?a/protein?g系統，以及鏈霉親和素-生物素系統的定向固定方法，可以將蛋白質上特異性的表位或標簽偶聯至固相載體上，但這些方法僅提供非共價蛋白連接，可能導致固定化蛋白從載體表面脫落[sensors?and?actuators?b:chemical,2017,243,104-113，the?analyst2013,138(7),2023，langmuir,2015,31(35),9728-9736，chemical?reviews,2009,109(9),4025-4053]。生物正交反應如胯連接、疊氮-炔鍵反應也能夠提供共價定向的蛋白固定化，但疊氮基團、炔烴基團等在天然蛋白質中不存在，需要額外引入非天然氨基酸[acscentral?science,2018,4,5,614-623,bioconjugate?chemistry,2019,30,3,531-535]。酶催化反應也能夠介導蛋白定向共價固定，例如sortasea，通過催化蛋白c端的lpxtg基序，使蛋白共價定向連接在修飾寡聚甘氨酸的載體上，但該過程需要添加過量的酶，且介導的固定化率較低(～30％)[macromolecular?bioscience,2015,15(10):1375-1380,biochemistry,2010,49,2604-2614]。
2、來自化膿性鏈球菌(streptococcus?pyogenes)中的纖連蛋白結合蛋白(fbab)的自連接系統spytag/spycatcher[proceedings?of?the?national?academy?of?sciences2012,109(12),e690-e697]，能夠在其第117位天冬氨酸(asp117)和第31位賴氨酸(lys31)間自發快速地形成異肽鍵[angewandte?chemie?international?edition,2010,49,8421-8425,journal?of?the?american?chemical?society,2011,133,478-485]。由于spy自連接系統特異性高，反應無需添加額外的酶和化學試劑，近年來在蛋白定向固定方面得到了廣泛的研究[analytical?chemistry,2019,91(15),9424-9429，biotechnology?letters,2021,43(5),1075-1087，biosensors?and?bioelectronics,2020,154,112052]。然而，實際上，spycatcher在不同固相載體上的固定并不總是順利的，可能會出現固定效率低或固定后結合活性低的問題。例如，最近的研究顯示，spycatcher在環氧瓊脂糖樹脂和乙醛基瓊脂糖樹脂的固定效率較低(～50％)[biotechnology?letters,2021,43(5),1075-1087，journal?of?chromatography?b,2023,1218,123591]；spycatcher修飾的環氧磁性微球對spytag-egfp的捕獲量較低(<40％)[biochemical?engineering?journal,2021,176,108182]。因此，解決野生型spycatcher的固定化問題引起了我們的興趣。spydock是spycatcher的非共價結合突變體，可以與spytag以非共價鍵連接，基于spydock結構對比野生型靈活性更低的特性，考慮結構靈活性更低的spydock可能更耐受外界環境的影響，如更耐受固定化過程的干擾[nature?communications,2019,10:1734，annals?of?the?newyork?academy?of?sciences,1998,864(1),1-8,science?reports?2017,7,41212]。
3、鑒于此，特提出本發明。
技術實現思路
1、為了克服現有技術的缺點與不足，本發明的目的在于提供一種spycatcher固定化突變體spyfixer及其應用。本發明將spydock中第77位的丙氨酸(a)進行突變為谷氨酸(e)，開發一種用于更利于固定化的spycatcher共價結合突變體spyfixer。該突變體spyfixer可以在多種載體表面固定化，通過spyfixer與不同載體表面的環氧基團或羧酸基團共價鍵連接得到spyfixer修飾的不同載體，再通過spy化學將spytag與目標蛋白的融合蛋白固定到spyfixer修飾的不同載體上，用于相互作用力、抗體純化、酶/蛋白固定化的應用；以解決現有spycatcher在許多載體表面上固定效率低、活性低，應用受限的問題。本發明選擇光纖生物傳感器ar2g、親水性環氧瓊脂糖樹脂、疏水性環氧丙烯酸酯樹脂作為三種類型固相載體實施例。
2、本發明基于spyfixer-spytag反應的特異性，首先制備spyfixer修飾的載體，通過spyfixer與載體的表面羧基或環氧基團發生共價反應，將spyfixer固定在載體上制備得到。再利用spy化學反應將spytag融合表達的目標配體特異地捕獲到spyfixer修飾的ar2g傳感器上，將分析物與結合目標配體的spyfixer修飾傳感器共同孵育，分析配體-分析物之間的相互作用。利用spy化學反應將spytag融合表達的protein?a的z?domain特異地捕獲到spyfixer修飾的環氧瓊脂糖樹脂上，通過洗脫，獲得高純度的目標抗體。經過洗滌、重生步驟后，結合z?domain的spyfixer修飾樹脂仍能繼續結合抗體，進行新一輪的純化。利用spy化學反應將spytag融合表達的目標酶特異地捕獲到spyfixer修飾的環氧瓊脂糖樹脂上，獲得可重復使用的固定化酶。將spytag融合表達的目標蛋白特異地捕獲到spyfixer修飾的環氧丙烯酸酯樹脂上，用于蛋白固定化。
3、本發明的目的通過下述技術方案實現：
4、一種spycatcher固定化突變體spyfixer，其氨基酸序列如seq?id?no：1所示。
5、一種所述spycatcher固定化突變體spyfixer的編碼基因。
6、在本發明的一種實施方式中，spycatcher固定化突變體spyfixer的編碼基因的核苷酸序列如seq?id?no：2所示。
7、上述spycatcher固定化突變體spyfixer相關的生物材料，為下述生物材料中的任意一種或多種組合：
8、(a)含有上述編碼基因的表達盒；
9、(b)含有上述編碼基因的重組表達載體；
10、(c)含有(a)中所述表達盒的重組表達載體；
11、(d)含有上述編碼基因的重組微生物；
12、(e)含有(a)中所述表達盒的重組微生物；
13、(f)含有(b)或(c)中所述重組表達載體的重組微生物。
14、進一步的，(b)、(c)中所述重組表達載體的出發載體為pet系列的載體等；優選為pet-30a(+)載體或pet-32a(+)載體。
15、進一步的，(d)、(e)、(f)中所述重組微生物對應的宿主微生物選自原核生物或酵母等；所述原核生物包括埃希氏菌屬(escherichia)、芽孢桿菌屬(bacillus)、沙門氏菌屬(salmonella)以及假單胞菌屬(pseudomonas)和鏈霉菌屬(streptomyces)等細菌。更具體而言，所述原核生物是大腸桿菌(escherichia?coli，e.coli)，具體可為大腸桿菌bl21(de3)。
16、一種固定化蛋白質，含有上述spycatcher固定化突變體spyfixer。
17、進一步的，所述固定化蛋白質是將上述spycatcher固定化突變體spyfixer固定在固相載體上制備得到。
18、所述固相載體包括表面帶有環氧基團或羧酸基團的固相載體；
19、進一步的，所述所述固相載體包括用于蛋白-蛋白相互作用的傳感器，用于蛋白純化的瓊脂糖樹脂，用于蛋白固定化的環氧樹脂，等。
20、上述spycatcher固定化突變體spyfixer、編碼基因、突變體spyfixer相關的生物材料或固定化蛋白質在制備spycatcher固定化突變體中的應用；
21、上述spycatcher固定化突變體spyfixer、編碼基因、突變體spyfixer相關的生物材料或固定化蛋白質在基于spyfixer-spytag反應從而實現蛋白相互作用檢測、蛋白免疫檢測、蛋白純化、蛋白固定化方面的應用。
22、用于相互作用力、抗體純化、酶/蛋白固定化的應用；以解決現有spycatcher在許多載體表面上固定效率低、活性低，應用受限的問題。本發明選擇光纖生物傳感器ar2g、親水性環氧瓊脂糖樹脂、疏水性環氧丙烯酸酯樹脂作為三種類型固相載體實施例。
23、在本發明的一種實施方式中，上述spycatcher固定化突變體spyfixer，解決在ar2g傳感器，環氧瓊脂糖樹脂和環氧丙烯酸酯樹脂上的固定化，實現在蛋白-蛋白相互作用、抗體純化、酶固定化方面的應用。所述方法包括以下步驟：
24、(1)將spyfixer與ar2g傳感器孵育，獲得spyfixer修飾的傳感器；將spyfixer與瓊脂糖環氧樹脂孵育，獲得spyfixer修飾的環氧瓊脂糖樹脂；將spyfixer與環氧丙烯酸酯樹脂孵育，獲得spyfixer修飾的環氧丙烯酸酯樹脂；
25、(2)用封閉緩沖液處理spyfixer修飾的ar2g傳感器；用封閉緩沖液處理spyfixer修飾的環氧瓊脂糖樹脂；用封閉緩沖液處理spyfixer修飾的環氧丙烯酸酯樹脂；
26、(3)將spytag與目標配體的融合蛋白和spyfixer修飾的ar2g傳感器孵育；將spytag與目標蛋白的融合蛋白和spyfixer修飾的環氧瓊脂糖樹脂孵育；將spytag與目標蛋白的融合蛋白和spyfixer修飾的環氧丙烯酸酯樹脂孵育；
27、(4)使用spyfixer修飾的ar2g傳感器檢測配體-分析物間的相互作用；使用spyfixer修飾的環氧瓊脂糖樹脂純化抗體和制備固定化酶；使用spyfixer修飾的環氧丙烯酸酯樹脂對目標蛋白進行固定化。
28、本發明所述的傳感器是常用于蛋白-蛋白相互作用檢測的商業化傳感器，如德國賽多利斯公司的ar2g傳感器、美國cytiva思拓凡生物科技公司的cm5芯片傳感器等。
29、本發明所述的環氧瓊脂糖樹脂是常用于蛋白純化的商業化瓊脂糖載體，如西安藍曉科技新材料股份有限公司的epoxy-activatedff、美國cytiva思拓凡生物科技公司的epoxy-activated?sepharosetm，美國賽默飛世爾科技的plus?couplingresin等。
30、本發明所述的環氧丙烯酸酯樹脂是常用于蛋白(酶)固定化的商業化環氧樹脂，如西安藍曉科技新材料股份有限公司的lx-1000ep、美國漂萊特公司的ecr8204、德國雷姆公司的c等。
31、本發明所述的spyfixer修飾傳感器包含ar2g傳感器和spyfixer，其中spyfixer的氨基與ar2g傳感器表面的羧基通過共價鍵連接；本發明所述的spyfixer修飾瓊脂糖樹脂包含環氧瓊脂糖樹脂和spyfixer，其中spyfixer的氨基與環氧樹脂的環氧基團通過共價鍵連接；本發明所述的spyfixer修飾丙烯酸酯樹脂包含環氧丙烯酸酯樹脂和spyfixer，其中spyfixer的氨基與環氧樹脂的環氧基團通過共價鍵連接。所述的spyfixer，是能與spytag或其變體反應形成異肽鍵連接的蛋白質，spyfixer的氨基酸序列如seq?id?no：1所示；
32、本發明所述的封閉緩沖液是本領域常用的環氧基團封閉緩沖液，如tris、甘氨酸、乙醇胺、牛血清白蛋白等；在本發明中，術語“封閉”是指將剩余的未與spyfixer發生反應的環氧基團反應完，其目的在于使環氧基團在第二步的捕獲過程中不再與目的蛋白發生反應。所述封閉緩沖液包括但并不僅限于乙醇胺，ph?8.5，甘氨酸，ph?8.5、tris-hcl，ph?7.4。
33、本發明所述的spytag的融合蛋白，包含spytag002與目標蛋白，或，spytag003與目標蛋白，還可以包含多肽接頭與親和標簽，多肽接頭位于spytag與目標蛋白之間，術語“親和標簽”是指在融合蛋白的n端或c端添加的親和標簽，便于后續目的蛋白的純化；所述的spytag與目標蛋白的融合蛋白可以是純化的融合蛋白，也可以是未純化的融合蛋白，如細胞裂解液；所述的spytag002、spytag003的氨基酸序列分別如seq?id?no：4和seq?id?no：5所示；所述的spytag可以在目標蛋白的c端或n端。所述的融合蛋白可以通過在原核生物、酵母或高等真核生物細胞中重組表達獲得，示例性的原核生物包括埃希氏菌屬(escherichia)、芽孢桿菌屬(bacillus)、沙門氏菌屬(salmonella)以及假單胞菌屬(pseudomonas)和鏈霉菌屬(streptomyces)的細菌。在優選的實施方案中，重組細胞是埃希氏菌屬細胞，優選是大腸桿菌(escherichia?coli)。在本發明的一個具體實施方案中，所使用的重組細胞為大腸桿菌bl21(de3)菌株細胞(novagen)。
34、本發明所述的目標蛋白可以是任何蛋白，如本發明實施例中所列舉的人類生長激素(hgh(g120r))(hgh的氨基酸序列如genbank：qkg82153.1中的第37-227aa所示)、proteina的z結構域(zdomain)氨基酸序列如genbank：wck11299.1中的第16-73aa所示、n-乙酰氨基葡萄糖脫乙酰酶(tpdac)氨基酸序列如中國專利申請公布號cn110951708a中的seq?idno.2所示、紅色熒光蛋白(rfp)氨基酸序列如rfp的氨基酸序列如genbank：ufq89828.1中的第2-236aa所示。所述的細胞裂解液的獲得方法，選自本領域常用的處理方式，可用于本發明的使宿主細胞破碎的方法包括但不限于以下處理方式：超聲、勻漿、高壓(例如在弗氏壓碎器中)、低滲(osmolysis)、去垢劑、裂解酶、有機溶劑或其組合，并且所述破碎在第一ph條件(即弱堿性ph，例如ph?7.2-8.5，優選ph?7.4)下進行，由此使得宿主細胞的細胞膜破碎，蛋白上清從破碎后菌體中釋放出來，且仍然保持可溶狀態。所述的純化的融合蛋白，可以通過親和標簽或csat純化獲得，在一些實施方案中，所述的親和標簽為常見的6×his標簽，位于目的蛋白的n端或c端。釋放出來的蛋白上清通過蛋白親和層析方式純化。重組細胞的細胞膜破碎后，通過離心的方法收集上清，除去不可溶的沉淀部分，然后通過融合蛋白的his標簽進行親和層析純化。
35、本發明所述的洗滌緩沖液是本領域常用的蛋白洗滌緩沖液，如磷酸鹽緩沖液(pbs)、tris-hcl緩沖液等。
36、本發明所述的z?domain結合的spyfixer修飾樹脂可多次重生使用，其重生由ph3.8，0.5m精氨酸溶液洗脫目標抗體，ph?2.0，6m鹽酸胍溶液和0.1m?naoh溶液洗滌樹脂實現。
37、在本發明中，spy反應是指spyfixer(seq?id?no：1)與spytag002(seq?id?no：4)或spytag003(seq?id?no：5)之間反應，形成異肽鍵，將spyfixer和spytag002或spytag003連接成一個蛋白。
38、本發明所述術語“切割”是指當ph轉變為6.2時，誘導mtuδi-cm內含肽，通過自我剪接反應，使自身從前體蛋白中分離出來，釋放天然n端目的蛋白。
39、本發明相對于現有技術具有如下的優點及效果：
40、(1)本發明的突變體spyfixer基于spydock，引入a77e突變位點得到。可以經大腸桿菌表達獲得，通過標準發酵工藝規模化生產，成本低；
41、(2)本發明的spyfixer被分別固定光纖生物傳感器ar2g，親水性環氧瓊脂糖樹脂和疏水性環氧丙烯酸酯樹脂上，獲得spyfixer修飾不同載體，其制備過程簡單；
42、(3)本發明的spyfixer修飾載體在與spytag標記的目標蛋白結合時無需添加額外的試劑或酶，反應快速，且具有高選擇性；
43、(4)本發明方法可實現spy化學在不同載體上的固定化應用，固定化效率、固定后結合活性優于野生型spycatcher和突變株spycatcher003，應用范圍更廣；
44、(5)完成抗體純化步驟后spyfixer修飾載體和固定到spyfixer修飾載體的蛋白可重復利用，具有潛在的工業利用價值。