背景技術(shù)：
1、新合成的真核生物mrna分子，稱(chēng)為初級(jí)轉(zhuǎn)錄本或前體mrna，在翻譯前要經(jīng)過(guò)加工。在前體mrna加工過(guò)程中，在轉(zhuǎn)錄本的3'端添加5'甲基化帽和大約200-250個(gè)堿基的poly(a)尾。由前體mrna到mrna的加工還經(jīng)常涉及前體mrna的剪接，90%-95%的哺乳動(dòng)物mrna在成熟過(guò)程中都會(huì)發(fā)生剪接。內(nèi)含子(或干擾序列)是前體mrna(或其編碼dna)中不存在于成熟mrna編碼序列中的區(qū)域。外顯子是保留在成熟mrna中的初級(jí)轉(zhuǎn)錄本區(qū)域。成熟mrna序列是通過(guò)剪接外顯子形成的。剪接接頭也稱(chēng)為剪接位點(diǎn)，5'側(cè)稱(chēng)為“5'剪接位點(diǎn)”或“剪接供體位點(diǎn)”，3'側(cè)稱(chēng)為“3'剪接位點(diǎn)”或“剪接受體位點(diǎn)”。在剪接過(guò)程中，上游外顯子的3'端與下游外顯子的5'端相連。因此，未剪接的前體mrna在內(nèi)含子的5'端有一個(gè)外顯子/內(nèi)含子接頭，在內(nèi)含子的3'端有一個(gè)內(nèi)含子/外顯子接頭。在成熟mrna中，外顯子在去除內(nèi)含子后在有時(shí)也被稱(chēng)為外顯子/外顯子接頭或邊界處是連續(xù)的。可變剪接，被定義為對(duì)外顯子的各種組合進(jìn)行剪接，經(jīng)常導(dǎo)致由單個(gè)基因產(chǎn)生多種mrna轉(zhuǎn)錄本。
2、反義技術(shù)是調(diào)節(jié)一種或多種特定基因產(chǎn)物(包括可變剪接產(chǎn)物)表達(dá)的有效方式，在許多治療、診斷和研究應(yīng)用中具有獨(dú)特的作用。反義技術(shù)背后的原理是，反義寡核苷酸與靶核酸雜交后，通過(guò)一系列rna調(diào)控機(jī)制(如無(wú)義介導(dǎo)的衰變(“nmd”)途徑)之一調(diào)節(jié)基因表達(dá)活動(dòng)，如轉(zhuǎn)錄、剪接或翻譯。nmd是一種進(jìn)化保守的rna監(jiān)控系統(tǒng)，最初被認(rèn)為可以選擇性地減輕提前終止密碼子(如由點(diǎn)突變導(dǎo)致)的有害影響。
3、ataxin-2?(“atxn2”)是一種rna結(jié)合蛋白，由位于人類(lèi)染色體12q24.12上的基因編碼，該基因編碼幾種mrna轉(zhuǎn)錄本變體(如ncbi登錄號(hào)nm_002973.4、nm_001310121.1、nm_001310123.1和nm_001372574.1)和多種蛋白異構(gòu)體(如ncbi登錄號(hào)np_002964.4、np_001297050.1、np_001297052.1和np_001359503.1)。atxn2是應(yīng)激顆粒組裝的調(diào)節(jié)器，與神經(jīng)退行性疾病的發(fā)病機(jī)制有關(guān)。atxn2蛋白異構(gòu)體中重復(fù)次數(shù)大于34次的多谷氨酰胺(“cag”)擴(kuò)展是脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)2型(“sca2”)疾病的致病原因。目前，未達(dá)到sca2臨界值的中間擴(kuò)展被認(rèn)為是肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(“als”)的一個(gè)危險(xiǎn)因素，而且atxn2在酵母、蒼蠅和als小鼠模型中顯示為tdp43毒性的調(diào)節(jié)因子。盡管世界各地的研究人員和醫(yī)療專(zhuān)家一直在努力解決與atxn2相關(guān)的遺傳疾病問(wèn)題，但對(duì)此類(lèi)疾病的安全有效治療仍有迫切需求。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、本公開(kāi)提供了可用于調(diào)節(jié)atxn2表達(dá)(如使用nmd途徑)的反義寡核苷酸(“aso”)構(gòu)建體，以及與之相關(guān)的組合物和方法。
2、在第一個(gè)一般方面，本公開(kāi)提供了一種與轉(zhuǎn)錄本中的靶區(qū)雜交的反義寡核苷酸，其中反義寡核苷酸與靶區(qū)雜交會(huì)改變(如降低)由轉(zhuǎn)錄本編碼的功能蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)。
3、在一些方面，轉(zhuǎn)錄本是前體mrna分子。
4、在一些方面，反義寡核苷酸的長(zhǎng)度為10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個(gè)核苷酸，或者長(zhǎng)度在上述長(zhǎng)度值中任意一對(duì)所定義的端點(diǎn)范圍內(nèi)。例如，在一些方面，反義寡核苷酸的長(zhǎng)度為15至25個(gè)核苷酸，或長(zhǎng)度為18至20個(gè)核苷酸。
5、在一些方面，靶區(qū)的長(zhǎng)度為10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個(gè)核苷酸。在一些方面，反義寡核苷酸的長(zhǎng)度等于靶區(qū)的長(zhǎng)度；在其他方面，反義寡核苷酸的長(zhǎng)度長(zhǎng)于靶區(qū)的長(zhǎng)度。
6、在一些方面，反義寡核苷酸包括seq?id?no:?10-137中任一序列的核苷酸序列。在一些方面，反義寡核苷酸包含與seq?id?no:?10-137中任一序列相比，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)核苷酸替換的核苷酸序列。在一些方面，反義寡核苷酸包含與seq?id?no:?10-137中任一序列相比，具有至少85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同一性的核苷酸序列。
7、在一些方面，反義寡核苷酸包含與seq?id?no:?10-12中任一序列的連續(xù)18~22-mer部分序列相同的核苷酸序列。在一些方面，反義寡核苷酸包括10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個(gè)核苷酸的序列，其與seq?id?no:?10-12中任一序列或其對(duì)齊部分相比，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)核苷酸替換。在一些方面，反義寡核苷酸包含與seq?id?no:?10-12的任何連續(xù)18~22-mer部分序列相同的核苷酸序列，具有1、2、3、4或5個(gè)核苷酸替換。
8、在一些方面，反義寡核苷酸包含與seq?id?no:?13-137中任一序列的連續(xù)10、11、12、13、14、15、16、17、18或19、20-mer部分序列相同的核苷酸序列。在一些方面，反義寡核苷酸包括10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30個(gè)核苷酸的序列，其與seq?id?no:?13-137中任一序列或其對(duì)齊部分相比，具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10個(gè)核苷酸替換。在一些方面，反義寡核苷酸包含與seq?id?no:?13-137中任何連續(xù)的15、16、17、18、19或20-mer部分序列相同的核苷酸序列，具有1、2、3、4或5個(gè)核苷酸替換。上述還考慮到在與seq?id?no:?13-137中任何連續(xù)的15~20-mer部分序列相同或基本相似的任何反義寡核苷酸中的插入或缺失，其插入或缺失1、2、3、4或5個(gè)核苷酸。
9、在一些方面，反義寡核苷酸包括一種或多種修飾的核苷酸。
10、在一些方面，一種或多種修飾的核苷酸包括對(duì)核糖基、磷酸基、核堿基或其組合的修飾。
11、在一些方面，核糖基的修飾包括2'-o-甲基、2'-氟、2'-脫氧、2'-o-(2-甲氧基乙基)(“moe”)、2'-o-烷基、2'-o-烷氧基、2'-o-烷氨基、2'-nh2、受約束核苷酸或其組合。在一些方面，受約束核苷酸包括鎖定核酸(lna)、乙基受約束核苷酸、2'-(s)-受約束乙基(“s-cet”)核苷酸、受約束moe、2'-o,4'-c-氨基亞甲基橋接核酸(2',4'-bnanc)、α-l-鎖定核酸、三環(huán)-dna或其組合。
12、在一些方面，磷酸基的修飾包括硫代磷酸酯、膦酰基乙酸酯(“pace”)、硫代膦酰基乙酸酯(“thiopace”)、酰胺、三唑、膦酸酯、磷酸三酯修飾或其組合。
13、在一些方面，核堿基的修飾包括2-硫代尿苷、4-硫代尿苷、n6-甲基腺苷、假尿苷、2,6-二氨基嘌呤、肌苷、胸苷、5-甲基胞嘧啶、5-取代的嘧啶、異鳥(niǎo)嘌呤、異胞嘧啶、一個(gè)或多個(gè)鹵代芳香基或其組合。
14、在第二個(gè)一般方面，本公開(kāi)提供了一種藥物組合物，包含至少一種反義寡核苷酸，其選自權(quán)利要求1-16中任一項(xiàng)的反義寡核苷酸，以及至少一種藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或緩沖劑。
15、在一些方面，至少一種反義寡核苷酸包括多個(gè)順序不同的反義寡核苷酸(如，藥物組合物可包括本文公開(kāi)的任何aso序列的混合物)。在一些方面，藥物組合物可包括2、3、4、5、6或更多不同的atxn2?aso序列。
16、在一些方面，至少一種反義寡核苷酸在組合物中以0.001至100mg/ml的量存在。在一些方面，至少一種反義寡核苷酸以單位劑量的量存在。在一些方面，單位劑量包括0.001至100mg。
17、在第三個(gè)一般方面，本公開(kāi)提供了一種治療有需要的受試者的疾病或病癥的方法，包括：a)向受試者施用有效量的本文公開(kāi)的任何反義寡核苷酸(或藥物組合物)；以及b)治療疾病或病癥。在一些方面，疾病或病癥是神經(jīng)退行性疾病(如脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)、als、帕金森病、額顳葉癡呆、阿爾茨海默病)或蛋白病疾病，如tdp43蛋白病。
18、在一些方面，治療疾病或病癥包括預(yù)防、減輕、減緩或消除疾病或病癥的一種或多種癥狀。在一些方面，治療疾病或病癥包括將受試者的運(yùn)動(dòng)功能改善至少1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、16%、17%、18%、19%、20%、21%、22%、23%、24%、25%、26%、27%、28%、29%、30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、60%、70%、80%、90%或100%，或在從上述任一值中選出的端點(diǎn)所定義的范圍內(nèi)的量。在一些方面，治療疾病或病癥包括將受試者的運(yùn)動(dòng)轉(zhuǎn)棒表現(xiàn)(motorrotarod?performance)改善至少10%、15%或20%。在一些方面，可以使用als功能評(píng)定量表修訂版(“alsfrs-r”)或本領(lǐng)域已知的任何其他指標(biāo)來(lái)確定改善程度。
19、在一些方面，有效量是足以減少 atxn2編碼的蛋白在受試者的至少一種細(xì)胞或組織中表達(dá)的量。在一些方面，細(xì)胞是神經(jīng)細(xì)胞(如浦肯野細(xì)胞)。在一些方面，有效量包括足以使受試者的一個(gè)或多個(gè)細(xì)胞中的濃度達(dá)到10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、210、220、230、240、250、260、270、280、290、300、310、320、330、340、350、360、370、380、390或400nm的量。在一些方面，本公開(kāi)的方法可包括施用藥學(xué)上可接受的劑型，該劑型包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100mg(或上述值中任意一對(duì)所定義的范圍內(nèi)的量)本文所述的一種或多種反義寡核苷酸。例如，適用于施用的液體制劑可包含1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20ml(或上述值中任意一對(duì)所定義的范圍內(nèi)的體積)溶液中的5-20mg本文所述的反義寡核苷酸。在一些方面，施用包括每天至少、最多或正好施用1、2、3、4或5次反義寡核苷酸或藥物組合物。在一些方面，反義寡核苷酸或藥物組合物是腸外施用的。
20、在第四個(gè)一般方面，本公開(kāi)提供了一種細(xì)胞，其包含本文公開(kāi)的任何反義寡核苷酸，或一種載體，其被配置為表達(dá)本文公開(kāi)的任何反義寡核苷酸。在一些方面，本公開(kāi)提供了脂質(zhì)納米顆粒或細(xì)胞外囊泡，其包含本文公開(kāi)的一種或多種反義寡核苷酸。
21、在第五個(gè)一般方面，本公開(kāi)提供了一種降低細(xì)胞中編碼atxn2異構(gòu)體的靶mrna的量或活性的方法，包括使細(xì)胞與配置為與靶mrna雜交的反義寡核苷酸接觸；并使靶mrna轉(zhuǎn)錄本降解(例如通過(guò)nmd)。在一些方面，反義寡核苷酸被配置為與 atxn2的外顯子8、外顯子9或外顯子8和外顯子9之間的內(nèi)含子區(qū)內(nèi)的多個(gè)連續(xù)核苷酸雜交。
22、為實(shí)現(xiàn)上述及相關(guān)目的，一個(gè)或多個(gè)方面包括下文全面描述并在權(quán)利要求中特別指出的特征。以下描述和附圖詳細(xì)闡述了一個(gè)或多個(gè)方面的某些說(shuō)明性特征。然而，這些特征僅代表了可應(yīng)用多個(gè)方面原理的多種方式中的幾種，本說(shuō)明旨在包括所有這些方面及其等效方式。