本發(fā)明涉及植物病毒生物檢測，具體涉及檢測番茄新德里曲葉病毒的抗體、膠體金試紙條及其制備方法。
背景技術(shù)：
1、番茄新德里曲葉病毒（tolcndv）屬于雙生病毒科菜豆金色花葉病毒屬，是一種單鏈環(huán)狀dna病毒，其基因組由兩條dna鏈（dna-a和dna-b）組成，分別編碼6-8個功能蛋白，其中dna-a負(fù)責(zé)病毒復(fù)制和轉(zhuǎn)錄調(diào)控，dna-b則參與病毒在植物體內(nèi)的移動。該病毒最早于1995年在印度新德里地區(qū)的番茄上被發(fā)現(xiàn)，主要通過煙粉虱以持久性方式傳播，現(xiàn)已在亞洲、歐洲和非洲等地廣泛傳播，成為全球性病害。
2、tolcndv侵染番茄后會導(dǎo)致葉片向上卷曲、黃化、植株矮化及果實(shí)畸形等癥狀，嚴(yán)重時可造成50%以上的產(chǎn)量損失。該病毒具有廣泛的寄主范圍，除番茄外，還可侵染甜瓜，南瓜，番茄，辣椒等30余種經(jīng)濟(jì)作物。tolcndv的檢測主要包括癥狀觀察、血清學(xué)檢測和分子生物學(xué)檢測三種方式。田間觀察中，tolcndv引起的葉片卷曲、黃化等癥狀易與其他雙生病毒（如tylcv等）混淆，僅憑癥狀難以準(zhǔn)確診斷。血清學(xué)檢測中，elisa和膠體金免疫試紙條是最常用方法，但由于雙生病毒間衣殼蛋白（cp）高度保守（不同種之間的氨基酸序列相似性可達(dá)85%以上），存在交叉反應(yīng)風(fēng)險，需通過篩選特異性單克隆抗體來提高檢測準(zhǔn)確性。分子生物學(xué)檢測是當(dāng)前最可靠的方法，常規(guī)pcr可特異性擴(kuò)增tolcndv的cp或rep基因片段；實(shí)時熒光定量pcr（qpcr）具有高靈敏度和定量能力，但需要精密儀器和專業(yè)的操作人員；而環(huán)介導(dǎo)等溫擴(kuò)增（lamp）技術(shù)需恒溫環(huán)境，40-60分鐘才可判斷結(jié)果，無法滿足快速檢測需求。
3、膠體金免疫試紙條因其操作簡便、快速（5-10分鐘內(nèi)可通過肉眼判讀結(jié)果）的特點(diǎn)，特別適合田間tolcndv的快速檢測。然而，由于雙生病毒科成員間衣殼蛋白（cp）的高度保守性，開發(fā)tolcndv特異性膠體金試紙條面臨較大挑戰(zhàn)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)思路
1、針對上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供檢測番茄新德里曲葉病毒的抗體、膠體金試紙條及其制備方法。本發(fā)明開發(fā)了特異性的單抗，采用該膠體金免疫試紙條能快速、特異、靈敏地檢測瓜類樣品內(nèi)的?tolcndv。該試紙條在5min即可用肉眼直接判讀結(jié)果，適用于田間檢測。
2、為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
3、本發(fā)明的第一方面，本發(fā)明提供了兩株雜交瘤細(xì)胞株，包括：（1）分泌番茄新德里曲葉病毒單抗3-f11-a8的雜交瘤細(xì)胞株tolcndv-cell?line-3-f11-a8，雜交瘤細(xì)胞株hybridoma?cell?line?3-f11-a8于2025年11月11日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱cctcc,地址為：中國武漢，武漢大學(xué))，保藏編號cctcc?no:c2025277。（2）分泌番茄新德里曲葉病毒單抗5-h1-c10的雜交瘤細(xì)胞株tolcndv-cell?line-5-h1-c10,雜交瘤細(xì)胞株hybridoma?cell?line?5-h1-c10，于2025年11月11日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心(簡稱cctcc,地址為：中國武漢，武漢大學(xué))，保藏編號cctccno:c?2025278。
4、本發(fā)明的第二方面，本發(fā)明提供了兩種單克隆抗體，番茄新德里曲葉病毒單克隆抗體3-f11-a8和番茄新德里曲葉病毒單克隆抗體5-h1-c10；其中，單克隆抗體?3-f11-a8由保藏編號為cctcc?no:c?2025277的雜交瘤細(xì)胞株分泌產(chǎn)生；單克隆抗體5-h1-c10由保藏編號為cctcc?no:c?2025278的雜交瘤細(xì)胞株分泌產(chǎn)生。
5、在某些實(shí)施例中，番茄新德里曲葉病毒單克隆抗體3-f11-a8的的重鏈可變區(qū)cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列如seq?id?no.1-3所示，輕鏈可變區(qū)cdr1和cdr3的氨基酸序列如seq?id?no.4和seq?id?no.5所示，輕鏈可變區(qū)cdr2的氨基酸序列為las。
6、在某些實(shí)施例中，番茄新德里曲葉病毒單克隆抗體5-h1-c10的重鏈可變區(qū)cdr1、cdr2、cdr3的氨基酸序列如seq?id?no.6-8所示；輕鏈可變區(qū)cdr1和cdr3的氨基酸序列如seq?id?no.9和seq?id?no.10所示，cdr2的氨基酸序列為fas。
7、本發(fā)明的第三方面，本發(fā)明提供了上述雜交瘤細(xì)胞株或單克隆抗體在制備檢測番茄新德里曲葉病毒的產(chǎn)品中的應(yīng)用。
8、本發(fā)明的第四方面，本發(fā)明提供了一種檢測番茄新德里曲葉病毒的膠體金免疫試紙條，所述膠體金免疫試紙條包括底板，依次搭接固定于底板上的樣品墊、免疫膠體金墊、硝酸纖維素?膜和吸水濾紙；所述免疫膠體金墊是結(jié)合有膠體金顆粒標(biāo)記單克隆抗體3-f11-a8的金標(biāo)墊；所述硝酸纖維素膜上沿樣品流動方向依次設(shè)有檢測線和質(zhì)控線，所述檢測線包被單克隆抗體5-h1-c10,?所述質(zhì)控線包被二次抗體。優(yōu)選的，所述二次抗體為羊抗鼠igg抗體。
9、在某些實(shí)施例中，所述檢測線與質(zhì)控線之間相距5?mm±1?mm。
10、本發(fā)明的第五方面，本發(fā)明提供了一種膠體金免疫試紙條的制備方法，包括以下步驟：
11、(1)調(diào)節(jié)膠體金溶液的ph為8.00-8.50，向膠體金溶液中加入單克隆抗體3-f11-a8,?使單克隆抗體3-f11-a8?的終濃度為8-12μg/ml;?混合均勻，室溫反應(yīng)35-45min,?加入bsa溶液終止反應(yīng)，靜置20-40min,?低速離心棄去凝聚的金膠粒沉淀，然后高速離心，棄去上清，沉淀物用金標(biāo)液復(fù)溶，制成含有膠體金顆粒標(biāo)記單克隆抗體-3-f11-a8的免疫膠體金溶液；
12、(2)將步驟(1)制備的免疫膠體金溶液涂在金標(biāo)墊上，得到免疫膠體金墊；
13、(3)將單克隆抗體5-h1-c10?和羊抗鼠igg抗體分別點(diǎn)射于硝酸纖維素膜上，形成含有檢測線和質(zhì)控線的硝酸纖維素膜；
14、(4)在底板上依次搭接固定樣品墊、免疫膠體金墊、硝酸纖維素膜和吸水濾紙，即制備得到膠體金免疫試紙條。
15、優(yōu)選的，步驟(1)中，所述膠體金溶液按照如下方法制備：
16、將10%四氯金酸溶液加熱至沸騰，攪拌?1min?混勻后立即一次性加入1%檸檬酸三鈉溶液?2.4ml，繼續(xù)加熱?5min，然后停止加熱，繼續(xù)攪拌?10min，轉(zhuǎn)速設(shè)置為?2-3檔，繼續(xù)攪拌?20?分鐘。停止攪拌后靜置至室溫。制備好的膠體金溶液應(yīng)無顯著漂浮物或沉淀，溶液顏色應(yīng)為紫紅色。
17、優(yōu)選的，步驟(1)中，所述膠體金溶液中的膠體金的粒徑為40nm。
18、優(yōu)選的，步驟(1)中，所述免疫膠體金溶液中膠體金顆粒標(biāo)記單克隆抗體3-f11-a8的濃度為10μg/ml。
19、優(yōu)選的，步驟(1)中，所述bsa溶液的質(zhì)量濃度為10%。
20、優(yōu)選的，步驟(2)中，免疫膠體金溶液涂在金標(biāo)墊上的涂覆量為50μl/cm2。
21、優(yōu)選的，步驟(3)中，單克隆抗體5-h1-c10?和羊抗鼠igg抗體均稀釋至1.5mg/ml,用量均為1μl/cm;?然后點(diǎn)射于硝酸纖維素膜上，分別形成檢測線和質(zhì)控線。
22、有益效果
23、(1)本發(fā)明首次制備了能夠特異性識別番茄新德里曲葉病毒的單克隆抗體3-f11-a8?和單克隆抗體5-h1-c10。將單克隆抗體3-f11-a8和5-h1-c10?組合使用能有效區(qū)分番茄黃化曲葉病毒（tomato?yellow?leaf?curl?virus，tylcv），中國南瓜曲葉病毒(squashleaf?curl?china?virus,?slccv)，苧麻花葉病毒(ramie?mosaic?virus,?ramov)，不存在交叉反應(yīng)。
24、(2)本發(fā)明的tolcndv膠體金免疫試紙條可準(zhǔn)確、特異、靈敏的檢測田間瓜類中的tolcndv。該試紙條在5min內(nèi)可通過肉眼觀察檢測結(jié)果，非常適合田間大批量樣品檢測，在實(shí)際生產(chǎn)中具有很好的應(yīng)用價值，對tolcndv的診斷、監(jiān)測及預(yù)警提供物質(zhì)支持。
25、