焦磷酸測序法檢測華法林個體化用藥基因多態性的試劑盒及方法

專利名稱：焦磷酸測序法檢測華法林個體化用藥基因多態性的試劑盒及方法
技術領域：
本發明屬于分子生物學領域，具體涉及焦磷酸測序法檢測華法林個體化用藥基因多態性的試劑盒及方法。
背景技術：
華法林是常用的香豆素類ロ服抗凝藥，用于預防和治療血栓栓塞性疾病(如心肌梗死、缺血性發作和血栓栓塞性靜脈炎等)以及心臟人工瓣膜置換術和人工血管移植術等術后抗凝治療。目前臨床常以凝血酶原時間(PT)及國際標準化比率(INR)作為其抗凝監測指標。但是華法林有效治療窗很窄，個體差異大(不同患者所需劑量可相差20倍)，初始劑量很難掌握，如果劑量不足將無法預防血栓栓塞，劑量稍大則會導致出血的危險(引起致命性和嚴重出血發生率分別為I. 3%和7. 2%)。華法林的臨床應用需要經過多次調整劑量方可達到目標INR值(范圍在2. (Γ3. O之間最佳)，這個劑量摸索的時間常常需要數周。近年來隨著遺傳藥理學與藥物基因組學的快速發展，研究發現影響華法林用藥劑量個體差異的主要原因是遺傳因素。研究表明影響華法林代謝的代謝酶細胞色素P4502C9 (CYP2C9)和華法林的作用靶點環氧化物還原酶復合體I (VKORCl)這兩個
基因單核苷酸多態性(SNP)可解釋約50%的華法林用藥劑量個體差異，對指導華法林合理應用具有巨大的臨床指導意義。細胞色素P450酶系(CYP450S)是ー組結構和功能相關的超家族酶系，約60%的藥物是由CYP450S代謝清除的。大量研究表明，CYP450S基因多態性是造成藥物代謝個體和種族差異的基礎。華法林主要由細胞色素P450酶系代謝，其中CYP2C9酶對華法林的代謝最為重要。華法林有兩種構象R和S。其中S-華法林的作用占6(Γ70%，而R-華法林只有3(Γ40%。S-華法林主要由CYP2C9代謝成無活性的代謝產物。CYP2C9基因多態性對華法林用藥劑量個體差異有顯著影響。CYP2C9基因型包括CYP2C9*1、CYP2C9*2、CYP2C9*3、CYP2C9*4、CYP2C9*5，其中對華法林代謝影響最重要的是*2和*3基因型。CYP2C9*31075A>C (rsl057910)突變導致CYP2C9酶活性降低，其活性僅為野生型的5 %，這種突變降低了酶活性使其底物的清除率降低，血藥濃度升高。因此，需降低臨床用藥劑量，防止不良反應的發生。在黃種人群中CYP2C9*2的突變率幾乎為零，而CYP2C9*3基因型突變率為3% 10%。維生素K在維生素K環氧化物還原酶復合物(VKORC)的作用下由環氧化形式轉化為氫醌形式(KH2)，參與維生素K依賴的凝血因子II、VII、IX、X及抗凝蛋白C和S的活化。VKORC亞單位I (VKORCl)是ー種多成分脂蛋白酶系統，位于內質網膜上，是維生素K依賴性凝血因子生成的限速酶。VKORCl是華法林的作用靶點，華法林通過抑制其活性，阻礙維生素K由環氧化物形式轉化成氫醌形式，從而阻斷上述凝血因子的活化，達到抗凝作用。目前已經有了大量VKORCl基因多態與華法林劑量相關性的研究報道。在亞洲人群中研究結果顯示，VKORCI的基因多態對華法林劑量差異的影響達到了 16-30%。其中VKORCl啟動子的基因多態性-1639G>A (rs9923231)是影響華法林需求劑量種族差異和個體差異的主要原因。在VK0RC1-1639G>A rs9923231基因多態性中，G和A等位基因的發生頻率分別為80. 5%和19. 5% ;而與A等位基因相比，G等位基因增加了近40%的酶活性。VKORCl酶活性的増加，還原性維生素K生成和凝血因子生成也増加，因此需要較高劑量的華法林才能達到抗凝效
果O綜上CYP2C9和VKORCl基因多態性是影響華法林需求劑量差異性的主要因素，開發快速、高效、準確、便捷、經濟的檢測CYP2C9和VKORCl基因多態性的試劑盒將為華法林的臨床個體化治療起到積極的推動作用。盡管目前用于檢測華法林用藥劑量相關的基因多態性的方法比較多，如聚合酶鏈式反應(PCR)、限制性內切酶酶解片段長度多態性(RFLP)、實時熒光定量聚合酶鏈式反應、核酸序列擴增實驗法、基因芯片等，這些方法比較快速、靈敏，但準確度不夠，并且交叉污染問題相對比較嚴重。
焦磷酸測序(Pyro sequencing)技術是新一代DNA序列分析技術,該技術無須進行電泳，DNA片段也無須熒光標記，是ー種通用型技術平臺。該技術具有操作簡便、檢測成本低、所需樣品量小、快捷、準確、高通量等特點，符合臨床大樣本檢測要求。

發明內容
藥物代謝酶CYP2C9和華法林作用靶點VKORCl基因多態性是影響華法林劑量個體差異的最主要因素。本發明提供一種檢測影響臨床華法林個體化用藥治療的用藥基因CYP2C9 (SEQ ID NO. I)和VKORCl (SEQ ID NO. 2)多態性的試劑盒及方法，以實現快速、簡便、準確、高效、實用、經濟的檢測華法林個體化用藥相關基因SNP。為了達到上述目的，本發明提供的技術方案為
一種焦磷酸測序法檢測華法林個體化用藥基因多態性的試劑盒，包括如下引物
(1)擴增引物
VKORCl -1639G>A (rs9923231)上游引物5、AGG GTT CAA GTG GTT CTC GT-3,(SEQ ID NO. 3)；
CYP2C9*3 1075A>C (rsl057910)上游引物5Λ- AGC CAC ATG CCC TAC ACA G -3^(SEQ ID NO. 4)；
VKORCl -1639G>A (rs9923231)下游引物5、GTC AAG CAA GAG AAG ACC TG~3r(SEQ ID NO. 5)；
CYP2C9*3 1075A>C (rsl057910)下游引物:5,- CCC GGT GAT GGT AGA GGT TTA-3, (SEQ ID NO. 6)；
其中，下游引物的5,進行生物素標記；
(2)測序引物
VKORCl -1639G>A (rs9923231)測序引物5、GTG AGC CAC CGC A -3 ^ (SEQ IDNO. 7)；
CYP2C9*3 1075A>C (rsl057910)測序引物5、CAC GAG GTC CAG AGA TA -3^(SEQ ID NO. 8)；
試劑盒中其他試劑及溶液為PCR和DNA焦磷酸測序的常規試劑。
一種應用上述試劑盒檢測華法林用藥基因多態性的方法，包括如下步驟
(O DNA提取；
(2)聚合酶鏈反應
配制 50 μ I PCR 擴增體系，包含10 X PCR buffer 10. Ομ I, dNTP 3. O μ 1，上游引物I. O μ 1，下游引物I. O μ 1，rTaql.Oy 1，水30. Ομ 1，模板4. Ομ I ;按照下面的循環參數設置擴增儀95 0C 5min預變性；然后依次在95°C 30S, 52°C 30S, 65°C 30S,進行38個循環；再在72°C保持5min，最終保持在4 °C，得擴增產物；
(3)焦磷酸測序單鏈樣本純化；
(4)焦磷酸測序及結果分析。 本發明的試劑盒對VKORCl-1639G>A (rs9923231)目標序列和 CYP2C9*3 1075A>C(rsl057910)目標序列進行分析和檢測；其中，VKORCl -1639G>A (rs9923231)目標序列包括野生型 GCACCCGGCCAATGG (SEQ ID NO. 9 )和突變型 GCACCTGGCCAATGG (SEQ IDNO. 10)，擴增出的片段長度為290bp ;CYP2C9*3 1075A>C (rsl057910)目標序列包括野生型 CATTGACCTT (SEQ ID NO. 11)和突變型01764011' (SEQ ID NO. 12)，擴增出的片段長為210bp。由于設計了特異性高的引物，并且選擇了合適的方法，本發明的試劑盒適用于對華法林個體化用藥基因進行快速檢測，可廣泛應用于臨床上華法林個體化用藥方案制定的基因檢測。與現有技術相比，其應用焦磷酸測序技術可以快速、準確地進行短DNA序列分析，便于構建標準化操作流程；具有高通量、低成本等特點；PCR產物即可直接用于測序，不需進行產物純化等二次處理，操作極為簡便，所需樣品量小。


圖I為本發明VKORCl -1639GG (rs9923231)焦磷酸測序結果；
圖2為本發明VKORCl -1639GA (rs9923231)焦磷酸測序結果；
圖3為本發明VKORCl -1639AA (rs9923231)焦磷酸測序結果；
圖4為本發明CYP2C9*3 1075AA (rsl057910)焦磷酸測序結果；
圖5為本發明CYP2C9*3 1075AC (rsl057910)焦磷酸測序結果；
圖6為本發明CYP2C9*3 1075CC (rsl057910)焦磷酸測序結果。
具體實施例方式下面結合實施例對上述試劑盒及檢測方法進行詳細描述。實施例I :
VKORCl -1639G>A (rs9923231)上游引物5、AGG GTT CAA GTG GTT CTC GT-3, (SEQID NO. 3)；
CYP2C9*3 1075A>C (rsl057910)上游引物:5,- AGC CAC ATG CCC TAC ACA G -3,(SEQ ID NO. 4)；
VKORCl -1639G>A (rs9923231)下游引物:5,-GTC AAG CAA GAG MG ACC TG-3XSEQID NO. 5)；
CYP2C9*3 1075A>C (rsl057910)下游引物5r- CCC GGT GAT GGT AGA GGT TTA -3,(SEQ ID NO. 6)；
VKORCl -1639G>A (rs9923231)測序引物5、GTG AGC CAC CGC A -3^ (SEQ IDNO. 7)；
CYP2C9*3 1075A>C (rsl057910)測序引物5、CAC GAG GTC CAG AGA TA -3^ (SEQID NO. 8)；
I. DNA提取
I. I實驗前試劑材料準備與檢查工作如下
(I)檢查試劑盒保質期以及確保Wash Buffer I和2中已添加こ醇，并在瓶上相應標識處打勾V ； (2)異丙醇(如無，可用無水こ醇替代)和75%こ醇；(3)高壓滅菌有效期內的I. 5mL Eppendorf管和各類移液槍頭。 I. 2從4°C冰箱中取出裝有全血的EDTA抗凝管，上下顛倒數次混勻；
I. 3在I. 5mL Eppendorf管對應標本卩隹一性標識做好標記；
I. 4 分別移取 900uL Cell Lysis Solution 加至滅菌的 I. 5mL Eppendorf 管；
I. 5小心移取300uL全血轉移至上述加有Cell Lysis Solution的I. 5mL EP管；
I. 6蓋上Eppendorf管蓋，室溫孵育IOmin ；
I. 713, OOOrpm室溫離心20秒；
I. 8取出Eppendorf管,觀察白色沉淀；
I. 9開Eppendorf管蓋，手持管底部，傾斜EP管ロ棄去部分紅色上清，盡量將紅色上清吸盡；
I. 10蓋上Eppendorf管,用手指彈擊EP管底部,使白色沉淀重懸；
1.11移取30011しNuclei Lysis Solution入上述Eppendorf管中，蓋上管，上下顛倒數次混勻；
I. 12 打開 Eppendorf 管，移取 IOOuL Protein Precipitation Solution 入上述Eppendorf管中，蓋上管管，振蕩器上劇烈振蕩20秒；13，OOOrpm室溫離心3min ；
I. 13移取上清轉移到新的已滅菌I. 5mL Eppendorf管；
I. 14移取300uL異丙醇入EP管，蓋上管蓋，上下顛倒數次混勻，可見白色絮狀gDNA析
出；
I. 15 13, OOOrpm 室溫離心 Imin ；
I. 16打開Eppendorf管，手捏管底部，傾斜管ロ棄去上清；
I. 17移取300uL 75%こ醇加入Eppendorf管，蓋上管蓋，輕柔上下顛倒洗滌沉淀；
I.18 13, OOOrpm 室溫離心 Imin ；
I.19打開Eppendorf管，手持管底部，傾斜管ロ棄去上清；
I.20在實驗臺上放置新濾紙,倒扣Eppendorf管，吸干液體,將Eppendorf管開蓋側放風干；
I.21目測沉淀大小，加入50 IOOul DNA Rehydration Solution至沉淀；
1.22過夜溶解后用Nano-Space紫外分光光度計進行核酸濃度測定，核酸濃度大于50ng/ul視為合格，如濃度不夠，加入こ醇再次沉淀DNA，然后重新加適量的DNARehydration Solution 溶解 DNA。I. 23在管壁和管蓋上再次標清樣本唯一性編號，并用透明膠帶纏繞保護；1.24保存核酸標本至4°C冰箱；
2.聚合酶鏈反應
2.1在試劑準備區配制50 μ I PCR擴增體系(模板添加除外)，各組分及添加量如下表
權利要求
1.一種焦磷酸測序法檢測華法林個體化用藥基因多態性的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包括如下引物(1)擴增引物上游引物5r- AGG GTT CAA GTG GTT CTC GT -3,；5^-AGC CAC ATG CCC TAC ACA G-3^ ； 下游引物GTC AAG CAA GAG AAG ACC TG -3^ ；5^-CCC GGT GAT GGT AGA GGT ΤΤΑ-3Λ ；其中，下游引物的5,進行生物素標記； (2)測序引物5r~GTG AGC CAC CGC A -3,； 5r~ CAC GAG GTC CAG AGA TA -3、
2.ー種應用權利要求I所述的試劑盒檢測華法林個體化用藥基因多態性的方法，包括如下步驟 (O DNA提取；(2)聚合酶鏈反應 配制 50 μ I PCR 擴增體系，包含10 X PCR buffer 10. 0μ I, dNTP 3. O μ 1，上游引物I. O μ 1，下游引物 I. Ομ I, rTaql. Ομ 1，水 30. Ομ 1，模板4· Ομ I ;循環程序為:95 oC 5min預變性；依次在95°C 30S，52°C 30S，65°C 30S，進行38個循環;72°C保持5min，最終保持在4 °e，得擴增產物；(3)焦磷酸測序單鏈樣本純化；(4)焦磷酸測序及結果分析。
全文摘要
本發明公開了一種焦磷酸測序法檢測華法林個體化用藥基因多態性試劑盒及方法。所述試劑盒對華法林用藥相關基因進行分型，包括VKORC1-1639G>A(rs9923231)和CYP2C9*31075A>C(rs1057910)單核苷酸多態性。試劑盒包含如SEQIDNO.3—8所示的引物。本發明的試劑盒，可以實現準確、快捷、高通量VKORC1-1639G>A和CYP2C9*31075A>C的檢測，從而達到對華法林用藥實現安全合理有效的個體化給藥。
文檔編號C12Q1/68GK102676666SQ20121013535
公開日2012年9月19日 申請日期2012年5月4日 優先權日2012年5月4日
發明者周宏灝 申請人:周宏灝