本發明屬于生物，涉及一種高產l-色氨酸的基因工程菌株及其構建方法和應用。
背景技術：
1、l-色氨酸作為一種必需氨基酸，在醫藥、食品和飼料工業中需求巨大。微生物發酵法是生產l-色氨酸的主流方式，其中大腸桿菌因其遺傳背景清晰、易于操作，成為重要的工程化宿主菌。
2、為提高產量，傳統的代謝工程策略主要集中在直接強化l-色氨酸的合成途徑本身，例如過表達trp操縱子基因、解除反饋抑制等。然而，l-色氨酸的合成高度依賴于前體物質的供應，特別是分支酸和谷氨酸。其中，谷氨酸作為連接碳氮代謝的核心分子，是色氨酸合成中吲哚環氮原子的直接供體，其胞內濃度常常成為限制產量的瓶頸。
3、近年來，研究逐漸從直接途徑改造轉向對全局調控因子的挖掘。例如，鞭毛合成主控因子flhd被發現具有超越其原本功能的全局調控作用。flhd基因的缺失會導致大腸桿菌產色氨酸能力下降，其機理可能與flhdc復合物抑制谷氨酸外排，從而影響胞內谷氨酸池有關。另一方面，琥珀酸半醛脫氫酶（gabd）催化琥珀酸半醛生成琥珀酸，同時產生nadph。該反應不僅補充了合成所需的還原力，其產物琥珀酸進入tca循環后，亦可增加α-酮戊二酸及下游谷氨酸的生成。
4、盡管flhd和gabd這兩個基因各自被認識到可能通過影響谷氨酸代謝間接關聯色氨酸合成，但現有技術中尚存在明顯空白：第一，尚未有研究報道通過對flhd或gabd基因本身進行特定的功能獲得性點突變（而非敲除或過表達）來精確調控這一代謝網絡；第二，更未有研究揭示這兩個分屬不同調控層級的基因之間是否存在協同效應，能否通過組合突變實現對l-色氨酸產量瓶頸的協同突破。
5、因此，開發一種基于關鍵調控節點協同改造的菌株構建策略，以更高效地提升前體供應和代謝流，對于突破現有l-色氨酸生產菌株的性能瓶頸具有重要價值。
技術實現思路
1、針對現有技術的不足和實際需求，本發明提供一種高產l-色氨酸的基因工程菌株及其構建方法和應用，通過引入突變flhd基因，同時結合gabd突變基因對大腸桿菌進行改造，共同提升細胞內谷氨酸這一前體物質的含量，顯著提升了l-色氨酸的產量，為l-色氨酸的工業化生產提供了新的思路。
2、為達到此發明目的，本發明采用以下技術方案：
3、第一方面，本發明提供了一種高產l-色氨酸的基因工程菌株，所述基因工程菌株表達突變型flhd蛋白和/或突變型gabd蛋白；
4、所述突變型flhd蛋白第84位氨基酸為苯丙氨酸；
5、所述突變型gabd蛋白第130位氨基酸為脯氨酸。
6、本發明通過在微生物中引入突變型flhd基因和/或突變型gabd基因來提升其l-色氨酸產量，其中所述突變型flhd基因使其編碼蛋白的第84位氨基酸變為苯丙氨酸（f），所述突變型gabd基因使其編碼蛋白的第130位氨基酸變為脯氨酸（p）。在大腸桿菌中同時引入突變型flhd基因使其編碼蛋白v84f和突變型gabd基因使其編碼蛋白t130p的雙突變，可使l-色氨酸產量較原始菌株提高約21.9%。
7、優選地，所述突變型flhd蛋白的氨基酸序列包括如seq?id?no.3所示的序列。
8、優選地，所述突變型gabd蛋白的氨基酸序列包括如seq?id?no.4所示的序列。
9、本發明中氨基酸的突變其中包括一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失、插入、添加或倒位，其中包括誘變、pcr定點突變法、和/或同源重組等方法中的至少一種，并且最終所修飾的序列與flhd基因編碼蛋白和gabd基因編碼蛋白的氨基酸序列有不少于90%的同源性，都在本發明的保護范圍內。
10、優選地，所述基因工程菌株包括重組大腸桿菌工程菌株。
11、第二方面，本發明提供一種第一方面所述的高產l-色氨酸的基因工程菌株的構建方法，所述構建方法包括：利用同源重組技術，將突變型flhd基因和/或突變型gabd基因整合至宿主微生物的基因組中，替換其相應的野生型基因，即得所述高產l-色氨酸的基因工程菌株。
12、優選地，所述同源重組技術包括：在宿主微生物中表達λ-red重組酶，將兩端帶有與基因組目標位點同源臂的線性dna片段電轉化進入所述宿主微生物，所述線性dna片段含有突變型flhd基因和/或突變型gabd基因，通過抗性篩選和基因型驗證獲得正確的重組基因工程菌株。
13、優選地，所述線性dna片段的制備方法包括：以含有突變型flhd基因和/或突變型gabd基因的質粒為模板，使用如seq?id?no.5-seq?id?no.8和/或seq?id?no.9-seq?idno.12所示的引物進行pcr擴增獲得；所述突變型flhd基因的核酸序列包括如seq?id?no.1所示的序列，所述突變型gabd基因的核酸序列包括如seq?id?no.2所示的序列。
14、seq?id?no.1（flhd突變基因核苷酸序列）：
15、atgcatacctccgagttgctgaaacacatttatgacatcaacttgtcatatttactacttgcacagcgtttgattgttcaggacaaagcgtccgctatgtttcgtctcggcataaatgaagaaatggcgacaacgttagcggcactgactcttccgcaaatggttaagctggcagaaaccaatcaactggtttgtcacttccgttttgacagccaccagacgattactcagttgacgcaagattcccgttttgacgatctccagcaaattcataccggcatcatgctctcaacacgcttgctgaatgatgttaatcagcctgaagaagcgctgcgcaagaaaagggcctga。
16、seq?id?no.2（gabd突變基因核苷酸序列）：
17、atgaaacttaacgacagtaacttattccgccagcaggcgttgattaacggggaatggctggacgccaacaatggtgaagccatcgacgtcaccaatccggcgaacggcgacaagctgggtagcgtgccgaaaatgggcgcggatgaaacccgcgccgctatcgacgccgccaaccgcgccctgcccgcctggcgcgcgctcaccgccaaagaacgcgccaccattctgcgcaactggttcaatttgatgatggagcatcaggacgatttagcgcgcctgatgaccctcgaacagggtaaaccactggccgaagcgaaaggcgaaatcagctacgccgcctcctttattgagtggtttgccgaagaaggcaaacgcatttatggcgaccccattcctggtcatcaggccgataaacgcctgattgttatcaagcagccgattggcgtcaccgcggctatcacgccgtggaacttcccggcggcgatgattacccgcaaagccggtccggcgctggcagcaggctgcaccatggtgctgaagcccgccagtcagacgccgttctctgcgctggcgctggcggagctggcgatccgcgcgggcgttccggctggggtatttaacgtggtcaccggttcggcgggcgcggtcggtaacgaactgaccagtaacccgctggtgcgcaaactgtcgtttaccggttcgaccgaaattggccgccagttaatggaacagtgcgcgaaagacatcaagaaagtgtcgctggagctgggcggtaacgcgccgtttatcgtctttgacgatgccgacctcgacaaagccgtggaaggcgcgctggcctcgaaattccgcaacgccgggcaaacctgcgtctgcgccaaccgcctgtatgtgcaggacggcgtgtatgaccgttttgccgaaaaattgcagcaggcagtgagcaaactgcacatcggcgacgggctggataacggcgtcaccatcgggccgctgatcgatgaaaaagcggtagcaaaagtggaagagcatattgccgatgcgctggagaaaggcgcgcgcgtggtttgcggcggtaaagcgcacgaacgcggcggcaacttcttccagccgaccattctggtggacgttccggccaacgccaaagtgtcgaaagaagagacgttcggccccctcgccccgctgttccgctttaaagatgaagctgatgtgattgcgcaagccaatgacaccgagtttggccttgccgcctatttctacgcccgtgatttaagccgcgtcttccgcgtgggcgaagcgctggagtacggcatcgtcggcatcaataccggcattatttccaatgaagtggccccgttcggcggcatcaaagcctcgggtctgggtcgtgaaggttcgaagtatggcatcgaagattacttagaaatcaaatatatgtgcatcggtctttaa。
18、seq?id?no.3（flhd突變蛋白序列）：
19、mhtsellkhiydinlsylllaqrlivqdkasamfrlgineemattlaaltlpqmvklaetnqlvchfrfdshqtitqltqdsrfddlqqihtgimlstrllndvnqpeealrkkra。
20、seq?id?no.4（gabd突變蛋白序列）：
21、mklndsnlfrqqalingewldanngeaidvtnpangdklgsvpkmgadetraaidaanralpawraltakeratilrnwfnlmmehqddlarlmtleqgkplaeakgeisyaasfiewfaeegkriygdpipghqadkrlivikqpigvtaaitpwnfpaamitrkagpalaagctmvlkpasqtpfsalalaelairagvpagvfnvvtgsagavgneltsnplvrklsftgsteigrqlmeqcakdikkvslelggnapfivfddadldkavegalaskfrnagqtcvcanrlyvqdgvydrfaeklqqavsklhigdgldngvtigplidekavakveehiadalekgarvvcggkaherggnffqptilvdvpanakvskeetfgplaplfrfkdeadviaqandtefglaayfyardlsrvfrvgealeygivgintgiisnevapfggikasglgregskygiedyleikymcigl。
22、seq?id?no.5（pflhd-f-1）：gacatcacggggtgcggtgaaac。
23、seq?id?no.6（pflhd-r-1）：gggtgatcaattccattgccagctga。
24、seq?id?no.7（pflhd-f-2）：aaccgcataaaaataaagttggttattctgggtgggaataatgcatacctccgagttgctgaaaca。
25、seq?id?no.8（pflhd-r-2）：atatcccgcgcttcctgaacaatgcttttttcactcatgatcaggcccttttcttgcgcag。
26、seq?id?no.9（pgabd-f-1）：ggcacgtagtgtggatgccttacac。
27、seq?id?no.10（pgabd-r-1）：ccacggggaatcgcctgactg。
28、seq?id?no.11（pgabd-f-2）：gccgcatttaatcaataacctttgaaaacaggatgtagcgatgaaacttaacgacagtaacttattcc。
29、seq?id?no.12（pgabd-r-2）：gctgcattaactctttattgctgttcattcgcattctccagttaaagaccgatgcacatatatttgatttcta。
30、優選地，所述宿主微生物包括大腸桿菌。
31、第三方面，本發明提供第一方面所述的高產l-色氨酸的基因工程菌株在生產l-色氨酸中的應用。
32、第四方面，本發明提供一種生產l-色氨酸的方法，所述方法包括以下：將第一方面所述的高產l-色氨酸的基因工程菌株接種至種子培養基中進行培養，獲得種子液，將種子液接種至發酵培養基中進行發酵培養，從發酵培養結束后的發酵液中回收l-色氨酸。
33、優選地，所述發酵培養的溫度為35-38℃（例如35℃、36℃或38℃），攪拌轉速為150-250?rpm（例如150?rpm、200?rpm、250?rpm），培養時間為20-28小時（例如20小時、24小時、28小時）。
34、與現有技術相比，本發明具有如下有益效果：
35、（1）產量提升顯著：通過引入突變型flhd基因編碼蛋白的v84f突變和突變型gabd基因編碼蛋白的t130p點突變，實現了對l-色氨酸合成途徑的協同強化，雙突變菌株的l-色氨酸產量較出發菌株提升達21.9%，效果遠超單基因突變；
36、（2）機理新穎：本發明首次發現并驗證了突變型flhd基因編碼蛋白的v84f點突變和突變型gabd基因編碼蛋白的t130p點突變能夠協同作用，通過優化前體供應和代謝流分配，可突破產量瓶頸；
37、（3）普適性強：該突變策略基于對核心代謝節點的調控，不僅適用于大腸桿菌，也為在其他l-色氨酸生產菌（如谷氨酸棒桿菌）中進行代謝改造提供了新的靶點和明確的技術啟示；
38、（4）工業應用前景好：本發明所述重組菌株生長速度快，遺傳背景清晰，易于進行工業化放大培養。