本發明涉及生物技術和免疫檢測領域，具體涉及一種凡納濱對蝦（ litopenaeus? vannamei）卵黃原蛋白（vitellogenin,?vg）的特異性多克隆抗體、其制備方法，以及基于該抗體和凡納濱對蝦vg受體蛋白（vitellogenin?receptor，簡稱vgr）的酶聯免疫吸附測定（elisa）定量檢測方法與應用。
背景技術：
1、公開該背景技術部分的信息僅僅旨在增加對本發明的總體背景的一些理解，而不必然被視為承認或以任何形式暗示該信息構成已經成為本領域一般技術人員所公知的現有技術。
2、凡納濱對蝦是全球水產養殖業的核心物種之一，其苗種的質量和數量直接制約著產業的可持續發展。在對蝦的繁殖過程中，卵黃原蛋白?是卵黃形成的關鍵前體蛋白。研究表明，甲殼動物的卵黃原蛋白來源包括內源合成（卵母細胞自身合成）與外源合成（卵母細胞以外的器官或組織合成，多指由肝胰腺合成）兩種途徑；其在肝胰腺合成后，通過血淋巴運輸至卵巢，被卵母細胞攝取并沉積為卵黃營養物質。因此，對蝦體內vg的含量已成為衡量其生殖潛能和性腺發育階段的最直接、關鍵的生物標志物。開發一種能夠準確、快速定量檢測對蝦vg的技術，對于優質親本選育、繁殖營養調控、監測養殖水域或自然水體中的污染物（如烷基酚、雙酚a等）以及生殖生理基礎研究具有重大的產業價值和科學意義。
3、在卵黃原蛋白檢測方面，現有技術主要針對魚類、多棘海盤車等物種，其vg蛋白與凡納濱對蝦的vg在氨基酸序列上差異顯著、同源性低，導致基于這些物種所開發的抗體及檢測方法在對蝦vg檢測中特異性和穩定性不足的問題。此外，目前主流的雙抗體夾心elisa方法嚴重依賴于識別不同表位的配對高親和力單克隆抗體。對于凡納濱對蝦vg而言，獲得這樣的配對抗體技術難度極大、研發周期長、成本高昂。正因上述技術瓶頸，目前尚缺乏針對凡納濱對蝦vg的、兼具高靈敏度與高特異性的可靠定量檢測手段，其定量精度亦受限制。因此，本領域迫切需要開發一種能夠克服配對抗體依賴、且具有高檢測性能的對蝦vg定量檢測新技術。
技術實現思路
1、本發明的目的在于克服現有技術的缺陷，設計對蝦科保守的多肽序列作為免疫原，制備多克隆抗體并開發檢測定量方法，具有高特異性、高親和力，為實現對蝦vg的準確、可靠、標準化檢測奠定了堅實基礎。本發明利用天然特異性結合對vgr-vg作為固相捕獲體系，替代傳統“雙抗體夾心”中對成對單克隆抗體的依賴，從而降低檢測體系構建難度并提高方法穩定性；同時，針對對蝦vg目前缺乏高靈敏度、高特異性檢測手段，且定量精度受限等問題，本發明提供了一種更適于定量分析的檢測方法。vgr介導的捕獲方式避免了抗體直接識別vg時可能存在的表位遮蔽問題。
2、本發明采用的技術方案如下：
3、本發明的第一個方面，提供一種凡納濱對蝦vg多克隆抗體，所述多克隆抗體由包含氨基酸序列如seq?id?no:1所示的多肽抗原免疫動物后制備獲得，所述seq?id?no:1為：cptkyeietegekv。
4、本發明的第二個方面，提供一種如第一方面所述的多克隆抗體的制備方法，包括以下步驟：
5、（1）抗原制備：化學合成具有seq?id?no:1所示氨基酸序列的多肽，并將其與載體蛋白交聯，純化后得到免疫抗原；
6、（2）動物免疫：使用步驟（1）得到的免疫抗原免疫動物；
7、（3）抗血清制備與純化：末次免疫后采集全血，分離血清，經純化得到所述抗凡納濱對蝦vg的多克隆抗體。
8、優選地，步驟（1）中，所述載體蛋白為鑰孔戚血藍蛋白（klh）。
9、優選地，步驟（2）中，所述免疫為多次免疫，包括初次免疫和至少一次加強免疫。
10、優選地，步驟（3）中，所述分離并純化包括：采集免疫動物的全血，分離血清，采用親和層析法純化血清中的免疫球蛋白g（igg）。
11、本發明的第三個方面，提供一種定量檢測凡納濱對vg的方法，采用凡納濱對蝦vg受體蛋白配體結合結構域作為固相捕獲分子，采用如第一個方面所述的多克隆抗體作為檢測抗體，通過酶聯免疫吸附測定（elisa）進行檢測。
12、優選地，所述配體結合結構域為凡納濱對蝦vgr蛋白的第93位至第295位氨基酸序列，具體序列如seq?id?no:7所示。
13、優選地，所述定量檢測方法為間接elisa法，包括以下步驟：
14、s1:?包被：用包被緩沖液將所述vgr配體結合結構域稀釋至工作濃度，加入酶標板孔中，孵育后洗滌；
15、s2:?封閉：加入封閉液孵育，洗滌；
16、s3:?加樣：加入梯度稀釋的vg蛋白標準品或待測樣品，所述待測樣品為凡納濱對蝦卵巢組織提取液，孵育后洗滌；
17、s4:?加一抗：加入稀釋后的如第一方面所述的多克隆抗體，孵育后洗滌；
18、s5:?加二抗：加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔igg，孵育后洗滌；
19、s6:?顯色與檢測：加入顯色底物溶液，反應后終止，檢測吸光度值；
20、s7:?定量分析：根據vg蛋白標準品濃度與吸光度值繪制標準曲線，計算待測樣品中vg的濃度。
21、本發明的第四個方面，提供一種用于定量檢測凡納濱對蝦vg的elisa試劑盒，包含：
22、（1）檢測抗體：如第一方面所述的多克隆抗體；
23、（2）固相載體：所述固相載體為酶標板，其上包被有凡納濱對蝦vgr配體結合結構域；
24、（3）標準品：vg蛋白標準品。
25、優選地，所述配體結合結構域為凡納濱對蝦vgr蛋白的第93位至第295位氨基酸序列，具體序列如seq?id?no:7所示。
26、優選地，所述vg蛋白標準品為凡納濱對蝦vg蛋白的第42位至第585位氨基酸序列（如seq?id?no:6所示）構成的重組蛋白。
27、優選地，所述試劑盒還包含：酶標記的二抗、緩沖液、顯色底物和終止液中的一種或多種。
28、本發明第五個方面，提供如第一方面所述的多克隆抗體在制備用于檢測凡納濱對蝦vg的檢測試劑中的應用。
29、優選地，所述檢測為western?blot定性或半定量檢測，或如第三方面所述的elisa定量檢測。
30、本發明第六個方面，提供如第一方面所述的多克隆抗體、第三個方面所述的方法或第四個方面所述的試劑盒在如下任一中的應用：
31、（1）檢測凡納濱對蝦性腺發育階段；
32、（2）凡納濱對蝦親本繁殖力評估與選育。
33、與本發明人知曉的相關技術相比，本發明其中的一個技術方案具有如下有益效果：
34、針對凡納濱對蝦vg蛋白的獨特保守表位（seq?id?no:1）設計合成抗原肽，westernblot驗證表明，該抗體在凡納濱對蝦卵巢組織蛋白樣本中識別單一特異性條帶。
35、本發明創造性地利用凡納濱對蝦自身的vgr配體結合結構域（vgr-lbd1）作為elisa的固相捕獲分子，取代了傳統雙抗體夾心法中的捕獲抗體。
36、基于上述原理建立的elisa方法，在采用重組vg蛋白的體系驗證中，展現出優異的分析性能：靈敏度較高（檢測下限可達24.4ng/ml）、線性范圍寬（0.0244-200?μg/ml）、重復性好（變異系數cv<10%）、準確性高，標準曲線線性相關系數r達0.9904，滿足精確定量分析的要求。
37、本發明提供的高特異性抗體，已通過western?blot證實可用于對蝦性腺組織等實際生物樣本中vg的定性/半定量檢測，為對蝦生殖生理研究提供了關鍵試劑。
38、本發明所建立的高性能elisa定量方法，為實現對組織勻漿等樣本中vg的定量檢測奠定了堅實的方法學基礎。
39、此外，本發明通過大量實驗篩選并確定了vgr蛋白中最關鍵的配體結合結構域（lbd1，seq?id?no:7）用于捕獲，以及vg蛋白中適于作為標準品的n端結構域（seq?id?no:6），確保了檢測體系的高靈敏度、高特異性與良好的可重復性。
40、綜上所述，本發明從根本上解決了因缺乏對蝦vg特異性抗體及配對抗體而無法建立定量檢測方法的技術瓶頸，為對蝦繁殖管理、親本選育等相關產業與科研需求提供了不可或缺的核心技術組件和完整解決方案。